QuEChERS/超高效液相色譜-串聯質譜法測定土壤中31種磺酰脲類除草劑殘留

李 瑩，韓 梅，邱世婷，雷紹榮，郭靈安，侯 雪

(四川省農業科學院分析測試中心，農業部農產品質量安全風險評估實驗室(成都)，四川 成都 610066)

自1982年美國杜邦公司報道第一個磺酰脲類除草劑品種氯磺隆后，磺酰脲類除草劑正式走進人們的視野[1]。由于磺酰脲類除草劑具有高效、低用量、低成本、高選擇性等特點，自開發以來得到了廣泛應用和快速發展[2-3]。目前，已被廣泛應用于防治水稻、麥類、大豆、玉米、油菜、草坪和其他非耕地的雜草。研究表明，磺酰脲類除草劑在土壤中的降解方式主要有化學水解和生物降解，但其降解速度受化合物結構、土壤pH值、溫濕度、土壤類別、土壤有機物含量等影響較大[4]。不同磺酰脲類除草劑具有不同的殘效期，一些殘效期較長的除草劑(如甲磺隆、綠磺隆、氯嘧磺隆、嘧磺隆等)，即使在土壤中微量殘留，也會對后茬敏感農作物、環境以及人體健康造成較大的影響[5-7]。土壤中磺酰脲類除草劑的消解及暴露風險評估研究表明：除草劑的原始殘留量和施藥量成正相關，而除草劑的殘留量直接影響致癌風險值的大小[6]。目前，已有50多種磺酰脲類除草劑被大量推向市場。2008年，苯磺隆等除草劑被列入美國環境保護署(EPA)公布的171種對人體具有潛在致癌作用的農藥目錄中[6，8-9]。因此，建立一種簡便、快速、靈敏、高效的土壤中磺酰脲類除草劑殘留的分析方法具有重要意義。

磺酰脲類除草劑的分析方法主要有毛細管電泳法(CE)[10-11]、高效液相色譜法(HPLC)[12-13]、高效液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS或HPLC-MS/MS)[14-15]與酶聯免疫吸附法(ELISA)[16]等，其中HPLC-MS/MS法因具有較高的選擇性和靈敏度，比較適合環境中痕量磺酰脲類除草劑的分析檢測。但土壤樣品基體比較復雜，含有不同大小的礦物顆粒，不同分解程度的有機殘體、腐殖質及生物活體、各種養分、水分、空氣等。同時，磺酰脲類除草劑在土壤中的殘留量通常較低，因此選擇一種高效、快速、穩定的樣品前處理方法，對于實現目標分析物的提取和分析至關重要。本研究參考美國AOAC 2007.01 QuEChERS標準方法[17]，對提取溶劑、凈化材料等加以優化，并結合超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用法，對土壤中31種磺酰脲類除草劑進行分析，建立了一種快速、簡便、高靈敏度的磺酰脲類除草劑的多殘留分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-30AD超高效液相色譜儀與LC MS-8060三重四極桿質譜儀聯用系統(日本島津公司)；Multi Reax多位試管渦旋振蕩器(德國海道夫公司)；Neofuge 18R臺式高速冷凍離心機(上海力申科學儀器有限公司)。31種磺酰脲類除草劑標準品(純度≥97%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；甲酸、乙酸、乙酸銨、甲酸銨、氨水(色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司)；NaCl(分析純，四川西隴科學有限公司)；無水MgSO4(≥98%，德國CNW科技公司)；N-丙基乙二胺(PSA)、C18、石墨化碳黑(GCB)(上海安譜實驗科技股份有限公司)；實驗用水為純凈水(由Milli-Q超純水儀制備)。

1.2 色譜與質譜條件

色譜條件：Shim-pack XR-ODS ⅢPKA-C18色譜柱(2.0 mm×150 mm，2.2 μm)；流動相：A為0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨，B為甲醇；總流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：1 μL。梯度洗脫程序：0～2 min，10%～50%B；2～8 min，50%～85%B；8～9 min；85%～95%B；9～10 min，95%B；10～10.1 min，95%～10%B；10.1～12 min，10%B。

質譜條件：ESI源；正、負離子模式同時掃描；接口電壓：4 000 V；多反應監測(MRM)模式；霧化氣(N2)流速：3.0 L/min；干燥氣(N2)流速：10.0 L/min；加熱氣(空氣)流速：10.0 L/min；接口溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；碰撞氣(Ar)壓力：270 kPa。

1.3 標準溶液配制

稱取適量各標準品，分別用甲醇配制成1 000 μg/mL儲備液，儲存于-20 ℃冰箱。分別準確量取一定體積的不同磺酰脲類除草劑儲備液，用乙腈定容配成20 μg/mL的混合標準溶液，保存于-4 ℃冰箱。根據實驗需要，用乙腈或土壤空白基質溶液稀釋混合標準溶液，配成不同質量濃度的標準工作溶液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品制備取土壤樣品500 g，人工除去石塊、樹枝等雜物，搗碎、研磨、混勻，過60目樣品篩，備用。

1.4.2 提取與凈化稱取5.0 g土壤樣品于50 mL離心管中，加3.0 mL水，常溫靜置10 min。加入20.0 mL 1%乙酸-乙腈、4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋1 min，以10 000 r/min離心5 min；取6.0 mL上層有機相于10 mL離心管中，加入900 mg無水硫酸鎂和150 mg C18，渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min，取2 mL上清液，過0.22 μm濾膜后，裝瓶待測。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

磺酰脲類除草劑由芳環、磺酰脲橋和氮雜環組成[18]，在ESI源的正離子模式下易形成[M+H]+母離子[19]。在流動相中加入甲酸有助于提高化合物的正離子化效率[14]，進而提高目標分析物的靈敏度，加入甲酸銨和乙酸銨可改善色譜峰峰形。分別考察了以甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨、甲醇-0.1%甲酸+3 mmol/L甲酸銨、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨為流動相時，對各待測化合物的峰形、分離效果以及離子化效率的影響。

結果表明：以甲醇-0.1%甲酸和乙腈-0.1%甲酸為流動相時，待測物的響應度較低，氯嘧磺隆在乙腈-0.1%甲酸體系中受雜質干擾嚴重。以甲醇-0.1%甲酸+3 mmol/L甲酸銨為流動相時，甲酰胺磺隆的峰拖尾，酰嘧磺隆和玉嘧磺隆的峰形較差。以乙腈-0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨為流動相時，唑吡嘧磺隆和氯嘧磺隆與雜質的分離效果差，三氟啶磺隆鈉、苯磺隆、乙氧磺隆等的響應低。而甲醇-0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨體系中，待測物的峰形、響應度及受干擾程度均有改善，因此最終選擇甲醇-0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨為流動相。

圖1 MRM模式下31種除草劑混合標準溶液(0.1 μg/mL)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of 31 herbicides’ mixed standard solution(0.1 μg/mL) in MRM mode

2.2 質譜條件的優化

采用正負離子同時掃描模式，對31種磺酰脲類除草劑的單標準溶液進行一級全掃描，得到穩定的母離子，大多數待測物均得到[M+H]+母離子，氯吡嘧磺隆得到[M-H]-母離子。經儀器自動優化，篩選出碰撞能量(CE)和信號較強的二級碎片離子作為子離子，確定最優質譜條件，使各待測物的離子化效率最佳。31種磺酰脲類除草劑的MRM參數見表1，0.1 μg/mL混合標準溶液的MRM色譜圖見圖1。

表1 31種磺酰脲類除草劑的質譜參數Table 1 MS/MS parameters of 31 sulfonylurea herbicides

(續表1)

No.CompoundRetention time(min)Parent ion(m/z)Product ions(m/z)Collision energy(V)22Bensulfuron methyl(芐嘧磺隆,BSFM)7.247411.05149.15*,182.15-19,-2023Azimsulfuron(四唑嘧磺隆,ASF)6.813425.20182.05*,139.05-19,-4224Flupyrsulfuron-methyl sodium(氟啶嘧磺隆,FSFMS)7.598488.10178.05*,332.90-20,-2125Ethoxysulfuron(乙氧磺隆,ESF)8.081399.10261.00*,139.00-17,-4026Cyclosulfamuron(環丙嘧磺隆,CCSF)8.322422.45261.05*,217.80-16,-2327Imazosulfuron(唑吡嘧磺隆,IZSF)8.021413.10153.10*,156.10-13,-2028Chlorimuron-ethyl(氯嘧磺隆,CRME)7.914415.00186.00*,83.05-21,-4229Primisulfuron-methyl(甲基氟嘧磺隆,PSFM)8.046469.00253.95*,198.90-20,-2230Pyrazosulfuron-ethyl(吡嘧磺隆,PZSFE)8.421415.00182.00*,139.00-20,-4231Halosulfuron methyl(氯吡嘧磺隆,HSFM)8.578433.00252.20*,154.2517,28

*quantitative ion

2.3 提取溶劑的優化

磺酰脲類化合物易受結構和體系pH值的影響而發生水解，尤其是苯磺隆受pH值的影響非常大[20]。為提高易水解化合物的穩定性，分別考察了乙腈、甲醇、0.1%乙酸-乙腈、1%乙酸-乙腈、1%氨水-乙腈作為提取溶劑的提取效果(圖2)。結果表明，采用1%氨水-乙腈提取時，煙嘧磺隆、甲酰胺磺隆、玉嘧磺隆的回收率僅為24.0%、27.5%、38.5%。采用0.1%乙酸-乙腈、甲醇、乙腈提取時，31種待測物的回收率分別為58.5%～98.0%、68.5%～101%、61.5%～105%。而采用1%乙酸-乙腈提取時，31種待測物的提取效果總體較好，回收率為68.0%～117%，各待測物的回收率在100%附近波動。因此，本實驗選擇1%乙酸-乙腈為提取溶劑。

圖2 31種除草劑在不同提取溶劑中的平均回收率(加標400 μg/kg)Fig.2 Average recoveries of 31 herbicides spiked with 400 μg/kg in different extraction solvents

2.4 凈化劑種類及用量的優化

土壤樣品基體較復雜，需采用凈化劑對樣品進行凈化，以避免土壤中有機質等對除草劑殘留量分析的影響。參考美國AOAC 2007.01 QuEChERS標準方法[17]，對凈化材料的種類(C18、PSA、GCB)和用量加以優化。

考察了分別以C18(25.00 mg/mL)、PSA(25.00 mg/mL)和GCB(5.00 mg/mL)為凈化劑時的凈化效果(圖3)，結果表明，C18的凈化效果相對較好，各待測物的回收率在70%～120%范圍內，PSA的凈化效果次之。GCB對各待測物的凈化效果差異較大，煙嘧磺隆(52.5%)、玉嘧磺隆(49.5%)、氟胺磺隆(56.0%)、芐嘧磺隆(40.5%)、乙氧磺隆(14.0%)、環丙嘧磺隆(46.0%)的回收率偏低。

圖3 31種除草劑在不同凈化劑下的平均回收率(加標400 μg/kg)Fig.3 Average recoveries of 31 herbicides spiked with 400 μg/kg under different purificants

進一步對C18用量(8.33、16.67、25.00、33.33 mg/mL)進行優化。結果表明，C18用量對各待測物的回收率影響不大，不同用量C18凈化后的回收率均為87.5%～114%。但在8.33、16.67、33.33 mg/mL C18用量下，環丙嘧磺隆、啶嘧磺隆回收率的相對標準偏差(RSD)大于15%。因此，最終選擇C18用量為25.00 mg/mL。

2.5 定容溶劑與定容方式的影響

實驗對定容溶劑及定容方式進行了考察。按照“1.4.2”的提取凈化過程，取2 mL上清液，A組溶液過0.22 μm微孔濾膜后裝瓶；B組溶液于40 ℃氮吹至近干，再用2 mL甲醇-水(1∶1，體積比)定容，過0.22 μm微孔濾膜后裝瓶；C組溶液取出1 mL上清液，用1 mL甲醇-水(1∶1)稀釋，過0.22 μm微孔濾膜后裝瓶。分別測定其回收率，結果表明：A組各待測物的回收率為83.5%～120%，C組和A組的回收率基本一致，但C組中氟酮磺隆鈉的回收率偏低；B組的回收率為56.5%～98.0%，尤其是玉嘧磺隆和乙氧磺隆在氮吹后受影響較大，可能是由于氮吹導致部分待測物損失，同時乙氧磺隆在甲醇中的溶解度較低所致。考慮到實驗的簡便性和各待測物回收率的穩定性，最終采用A方案，即取上清液直接過0.22 μm微孔濾膜后裝瓶測定。

2.6 基質效應

基質效應(ME)是指由于共洗脫雜質的干擾導致分析物信號的增強和減弱現象[19]。在復雜樣品的分析中，基質效應會影響離子的電離程度，進而對目標化合物的定量結果造成影響[7]。本實驗按照“1.3”配制基質匹配標準溶液，并以1%乙酸-乙腈配制相同質量濃度的各待測物標準溶液，采用本方法進行樣品前處理和測定，分別以峰面積和質量濃度繪制標準曲線，通過比較兩條標準曲線的斜率判斷基質效應的強弱。當|ME|<20%時為弱基質效應；當20%≤|ME|<50%時為中等強度基質效應；當|ME|≥50%時為強基質效應[21]，計算公式如下：ME(%)=(Sm/Ss-1)×100,式中：Sm和Ss分別表示基質標準曲線和溶劑標準曲線的斜率。

結果表明：除煙嘧磺隆、三氟啶磺隆鈉、玉嘧磺隆、啶嘧磺隆、氯吡嘧磺隆表現為中等強度基質效應外，其余待測物表現為弱基質效應，可忽略基質效應的影響(見表2)，說明QuEChERS法的凈化效果較好。對于煙嘧磺隆等5種中等基質效應的待測物，需配制基質匹配標準溶液進行定量分析，其余待測物則采用試劑標準溶液進行定量。

2.7 方法學考察

2.7.1 方法的線性與定量下限按照“1.3”配制質量濃度為0.001～0.5 μg/mL的31種磺酰脲類除草劑混合基質標準溶液，采用本方法進行樣品前處理和測定。以各待測物的質量濃度(x，μg/mL)為橫坐標，對應峰面積(y)為縱坐標繪制校準曲線，結果顯示，31種除草劑的線性關系良好，相關系數(r2)均不小于0.998 0。按10倍信噪比(S/N=10)計算定量下限(LOQ)，31種除草劑的LOQ為0.012～2.321 μg/kg(表2)，方法靈敏度可滿足土壤中目標物的檢測要求。

表2 31種除草劑的線性范圍、線性方程、相關系數、基質效應、定量下限和標準定量下限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients(r2),matrix effects,limits of quantitation(LOQ) and limits of quantitation in NY/T 2067-2011 of 31 herbicides

*no data

2.7.2 方法準確度與精密度在空白土壤樣品中添加10、100、400 μg/kg的31種除草劑混合標準溶液進行回收率實驗，每個加標濃度重復測定6次。由表3可知，31種除草劑的平均回收率為71.8%～119%，相對標準偏差(RSD)為0.62%～13%，表明所建立的方法具有較好的準確度和精密度，能夠滿足實際樣品分析的需求。

表3 31種除草劑在土壤中的加標回收率及相對標準偏差(RSD)(n=6)Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSD) of 31 herbicides in soil(n=6)

(續表3)

CompoundSpiked 10 μg/kgSpiked 100 μg/kgSpiked 400 μg/kgRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)SMTM93.02.694.92.385.30.62ADSF1108.095.96.21015.0MSFM1024.897.62.089.32.2FSF87.98.588.66.580.12.8TFSFS1001.597.72.174.75.2RSF1091391.08.280.27.8TBM94.75.691.14.785.74.1MSSFM99.67.696.80.6988.83.2OTSF97.59.786.56.488.05.0ISFMS99.38.399.74.679.45.6FTF98.15.81011.982.83.7TRFSFM94.27.81043.982.02.0SFSF97.54.81024.385.21.4FZSF98.95.686.29.890.13.3BSFM99.82.598.53.282.91.6ASF96.48.892.62.985.81.9FSFMS95.56.990.45.679.75.7ESF102111046.790.05.1CCSF1157.21071189.88.0IZSF98.51396.87.283.34.8CRME1193.51132.888.22.0PSFM1033.71023.383.73.6PZSFE96.68.895.21180.41.4HSFM1037.072.03.31023.7

2.8 實際樣品的測定

采用本方法對隨機選取的200份土壤樣品進行測定，結果顯示：共有6個樣品有檢出，其中4個樣品檢出煙嘧磺隆，檢出值分別為3.04、1.64、2.64、2.64 μg/kg；1個樣品檢出噻吩磺隆(3.92 μg/kg)，1個樣品檢出芐嘧磺隆(8.44 μg/kg)。土壤空白基質添加0.1 μg/mL的混合標準溶液，按照本方法進行前處理和測定，加標回收率為73.4%～103%，其中煙嘧磺隆、噻吩磺隆、芐嘧磺隆的回收率分別為103%、91.2%、95.4%。分析表明：煙嘧磺隆、噻吩磺隆、芐嘧磺隆的檢出值均大于本方法的LOQ，且該方法的LOQ低于目前標準規定的LOQ，表明該方法具有較高的靈敏度。

3 結 論

本文建立了一種結合QuEChERS前處理技術和UHPLC-MS/MS測定土壤中31種磺酰脲類除草劑殘留的分析方法。該方法前處理簡單，樣品用量少，分析速度快，線性范圍寬，準確度、精密度及靈敏度好，適用于大批量土壤中磺酰脲類除草劑殘留的篩查和風險監測。