聚集誘導發光材料在生物分子檢測中的應用

馬拉毛草，馬恒昌

(1.西北師范大學 逸夫圖書館，甘肅 蘭州 730070；2.西北師范大學 化學與化工學院，甘肅 蘭州 730070)

2014年諾貝爾化學獎頒發給了發現超高分辨率熒光顯微技術的三位科學家，該技術的發現實現一場細微至分子水平的熒光檢測技術變革[1-2]。在2001年，唐本忠院士研究小組首次提出“聚集誘導發光”(AIE)的概念突破了傳統熒光材料在聚集態時極易發生熒光猝滅(ACQ)的缺陷，實現了AIE材料在化學、生物、醫學等各個方面的快速發展[3]。與ACQ熒光團相反，聚集誘導發射(AIE)材料在單分子溶液中不發光或者發光很弱，但在聚集體形成時強烈地發射，熒光急劇增強[4]。可以說，AIE現象的發現為熒光材料領域提供了一個嶄新的研究方向。目前AIE熒光材料已很好地應用在了生物成像、醫學診斷以及治療的各個方面，并取得了矚目的研究成果[5-6]、基于研究者們對于AIE研究的深切關注，RIM機制的AIEgens已經開發了許多，如四苯乙烯(TPE)[7]、六苯基噻咯(TPS)[8]、喹啉腈(QM)[9]和有機硼配合物[10]等。已有多種基于AIE傳感原理，總結如下：①自組裝與分析物形成高度發射通過各種非共價相互作用聚集，包括靜電、氫鍵、范德華和金屬-配體相互作用[11]；②與靶向配體的絡合，通過限制分子內運動來識別分析物和開啟熒光[12]；③與酶或特定化學物質反應以裂解溶解促進配體并降低溶解度以形成聚集體[13]；④光物理猝滅過程的破壞，例如光致電子轉移(PET)[14]、分子內電荷轉移(ICT)[15]和熒光共振能量轉移(FRET)[16]過程。本文綜述了AIE的產生機理以及在生物檢測方面的應用，并對AIE材料在未來的應用前景進行了展望。

1 AIE的機理

從AIE的機理出發研究潛在機制對于尋求光物理學的基礎知識非常重要。它將指導我們設計新型發光劑，探索實際應用和促進技術創新的發展。自從2001年AIE概念出現以來，研究人員一直努力去揭示AIE現象的真正機制和原因。已經假設了許多機理途徑，包括構象平面化、J-聚集體形成、E/Z異構化、扭曲分子內電荷轉移(TICT)和ESIPT[3]。本文對AIE產生的機理進行了總結，主要分為分子內振動受阻(RIR)[17]、分子內旋轉受阻(RIV)[18-19]和分子內運動受限(RIM)[20-21]。

1.1 分子內振動受阻(RIR)

目前對于AIE機理的一種說法是分子內振動受阻(RIR)，研究者們以六苯基噻咯(HPS)為例[17]，仔細研究了HPS的結構，發現在一個HPS分子中，噻咯核心共裝飾有六個苯基通過單鍵連接，分子像螺旋槳一樣構造，外圍苯環和中心硅雜環平面之間存在大的扭轉角度。由于其高度扭曲以及和相鄰的苯環之間的空間位阻，一種致密的面對面堆疊結構不可能存在，因此，HPS分子實際上在固態下沒有π-π堆疊相互作用。

1.2 分子內旋轉受阻(RIV)

1.3 分子內運動受阻(RIM)

RIM機制是RIR和RIV機制的統一。RIM的結果說明RIR和RIV機制不是相互排斥的，而是可以共同起作用來實現AIE現象。它可以試圖解釋和創造其它關于AIE的熒光材料的設計與開發，可以增強孤立單分子的非輻射衰減，然而結構剛性阻擋這些無輻射通道，通過輻射通道引導激子的弛豫，即導致強烈的熒光發射[20-21]。

2 AIE熒光材料在生物檢測方面的應用

在生活的各個領域中，對于物質檢測仍然充滿著無限的吸引力，需要分析無數的生物物種，需要揭示、監測甚至調節無數的生物/生理過程[22]。發光技術憑借其卓越的靈敏度、簡單性、快速性、可視性、實時性和現場響應性、經濟適用性、高時空分辨率、無創性等優點，已成為生物應用的理想選擇[23]。鑒于此，發光可以作為生物分析過程的直接可視化的有用工具[24]。如今，發光材料一直是科研領域熱點研究方向之一。各種各樣的發光材料，包括有機染料[25]、有機納米粒子[26]、無機納米粒子[27]和熒光蛋白[28]已被開發并用作生物探針。

然而，大多數有機發光體通常具有ACQ效應，一旦發光體分子聚集，由于π-π堆積，發光將部分或完全淬滅，這種效果極大地限制了它們作為生物探針的應用[5]。與傳統的在聚集態下引起的ACQ材料相反，新出現的聚集誘導發射材料在聚集狀態下具有高發射效率、高信噪比、強光穩定性和大斯托克斯移位，這為各種傳感材料應用提供了獨特的機會[3]。

2.1 生物小分子識別探針

2.1.1 ATP檢測探針 在2017年，陸仲林課題組設計了一種AIE型的ATP分子探針[29]。由于Cu2+和5-三磷酸腺苷(ATP)在細胞代謝過程中起重要作用，因此建立人工化學傳感器檢測它們具有非常重要的意義[30]。作者基于四苯乙烯(TPE)兩親物在水溶液中自組裝產生聚集誘導發射(AIE)膠束，用于序列識別Cu2+和ATP，并且具有高選擇性和高靈敏度。具體思路是將Cu2+引入探針的100%水溶液中，就形成由探針和Cu2+以1∶2化學計量組成的復合物，導致顯著的熒光猝滅。在原位生成的Cu2+溶液中加入ATP可以很容易地恢復系統的熒光。Cu2+和ATP的檢測限(LoD)為1.0×10-7mol/L和1.5×10-6mol/L。該復合物均具有低細胞毒性和良好的細胞膜通透性，已成功應用于HepG2細胞中的對Cu2+離子的檢測和ATP圖像。

2.1.2 Ag+檢測探針 在2017年，Atul Goel課題組設計了一個Ag+識別探針[12]。通過簡便途徑合成新的四苯乙烯(TPE)結合物，該獨特的基于TPE的聚集誘導發射的化合物，當研磨時發射從藍色變為綠色時，顯示出明顯的壓致變色性質，當用溶劑還原時熒光發射從綠色又變到藍色。通過TPEN的壓致變色特性，可以制備用于安全文檔的無墨可重寫紙。TPEN的詳細光物理研究表明，發現其對銀離子(Ag+)的敏感性高于其他金屬離子，在水系統中檢測限為0.25 μmol/L。在光物理研究中，在質量分析和高分辨率質譜分析的基礎上，TPEN和銀離子的絡合物的化學計量被確定為2∶1(TPEN∶Ag+)。

2.1.4 H2S檢測探針 目前溶酶體中H2S響應性熒光探針通常具有ACQ現象并且遭受不可避免的背景熒光信號[32]。為了解決這個問題，2018年，陳建課題組將具有H2S識別的聚集誘導發射材料與光致變色螺吡喃部分結合起來，設計出了新型光路轉換型AIE納米探針(DNBS-DCM-SP)[33]，用于溶酶體中H2S的檢測。在H2S存在下，吸電子DNBS部分將通過H2S誘導的Se—O鍵斷裂，在約592 nm處熒光發生明顯的增強。制備得到的納米探針顯示出良好的靈敏度(5.0 nmol/L)和高特異性(特別是針對其他硫醇)。此外，H2S激活的AIE納米探針(DCM-SP)的熒光可以通過選擇性熒光共振能量轉移(FRET)，通過交替的紫外/可見光照射從AIE熒光團(DCM)可逆地切換到螺環吡喃的開環狀態。并且，通過觀測活細胞內源性H2S的產生以及可逆雙色熒光成像，也證明了制備的光可切換AIE納米探針的可行性。

2.1.5 氨基酸檢測探針 氨基酸作為構成蛋白質的基本單位，與基體正常表達有著非常直接的關系，因此，對于氨基酸的檢測顯得尤為重要[34]。2019年，馬驤課題組開發了具有結構簡單的紅色熒光發射材料，通過簡單地將共同電子給體(D)和受體(A)通過π橋結合，設計了一種具有分子內電荷轉移(ICT)效應的新型簡單AIE活性紅色發光體，并通過逐步不對稱Knoevenagel縮合簡便地合成。其AIE屬性來自非平面3D配置和多個轉子，ICT效應源于其D-A電子結構[35]。這種醛基官能化的AIEgen具有以點亮方式特異性檢測含巰基氨基酸的能力，在2 min內具有顯著的熒光藍移。動力學的顯著差異使得該探針能夠區分半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)與谷胱甘肽(GSH)。更重要的是，它顯示出對Ccy的Hcy更高的敏感性。此外，當Cys濃度高于250 μmol/L時，顯著的熒光增強和Hcy的紫外-可見吸收光譜中的明顯藍移顯示出該AIEgen可用作Cys/Hcy相關指示劑的潛力。

2.2 生物大分子識別探針

由于臨床診斷的強烈要求，生物大分子的熒光傳感引起了人們的廣泛關注。已經開發出AIE傳感器用于感測各種生物大分子，例如霍亂毒素[36]、凝集素[37]、γ-球蛋白[38]和G-四鏈體DNA[39]。

2.2.1 肝素識別探針 近年來，用于構造人工功能材料的分級自組裝研究引起了人們的廣泛關注。基于配位鍵的離散金屬環已被證明是通過分級自組裝制造各種超分子聚合物或智能軟物質的有效途徑。

在2015年，楊海波課題組通過多次靜電相互作用，利用有機鉑(II)金屬環骨架的正電荷，提出了離散金屬環的分級自組裝的第一個例子[40]。肝素是一種廣泛用作抗凝血藥物的硫酸化糖胺聚糖聚合物，由于存在多種負電荷，因此被選擇用于誘導分級自組裝。為了研究分級自組裝過程，通過配位驅動的自組裝將聚集誘導發射(AIE)活性部分四苯基乙烯(TPE)引入金屬環。光物理研究表明，在tris-TPE金屬環狀溶液中加入肝素可以顯著增強熒光，這有助于金屬環和肝素之間的聚集，這是由多種靜電相互作用驅動的。此外，通過SEM、TEM和LSCM實驗檢測到的糾纏珍珠項鏈網絡是通過分層自組裝獲得的。特別地，在AFM和TEM圖像中觀察到單珠狀鏈，其為帶正電荷的金屬環和帶負電荷的肝素的聚集提供直接的視覺證據。更有趣的是，進一步的光學研究表明，這種TPE裝飾的金屬環可以作為肝素檢測的開啟熒光探針，具有高靈敏度和高選擇性。

2.2.2 半胱天冬酶-3識別探針 在2016年劉斌課題組報道了一種自我驗證的熒光探針[41]，其由作為能量供體的香豆素熒光團和具有聚集誘導的發射特征的熒光劑(AIEgen)組成，作為通過半胱天冬酶-3特異性肽底物連接的能量猝滅劑。與傳統上廣泛研究的熒光共振能量轉移(FRET)探針不同，該課題組設計的新一代FRET探針本身是非熒光的，因為能量轉移以及通過AIEgen的自由分子運動耗散受體能量。在與半胱天冬酶-3相互作用后，由于供體-猝滅劑的分離和釋放的AIEgen的聚集，探針同步顯示強綠色和紅色熒光信號。雙信號放大的熒光開啟允許實時和自我驗證的酶檢測具有高信號背景比，提供了以實時方式準確監測各種生物過程的良好機會。

2.2.3β-半乳糖苷酶識別探針 在2017年，王江國課題組開發了一種β-半乳糖苷酶的檢測探針[42]。首先，作者通過測量其正辛醇/水分配系數(logP)來評估TPE-Gal的親水性。TPE-Gal的logP確定為0.6，表明其兩親特性，這有利于細胞滲透。還使用MTT方法研究了TPE-Gal對HeLa細胞的細胞毒性，結果發現細胞活力幾乎不受10 mmol/L TPE-Gal的影響，表明TPE-Gal的細胞毒性低。然后建立模型，利用來自人卵巢癌患者的OVCAR-3細胞已證實內源性b-半乳糖苷酶，TPE-Gal的過度表達，顯示內源性b-半乳糖苷酶的明顯增亮成像，并且，信號被點亮后又急劇下降。總之，鑒于TPE-Gal的簡單性，高特異性和生物相容性，這種策略可能在癌癥診斷和評估癌癥化療的效率方面具有很高的應用潛力。

2.2.4 堿性磷酸酶(ALP)識別探針 2014年，唐本忠課題組通過對2′-羥基查爾酮的簡單修飾，開發了一種新型比率熒光生物探針[43]，具有AIE特征和ESPIT特性，可用于緩沖液和血清樣品中的ALP活性測定。在存在ALP的情況下，生物探針的發射從黃綠色變為紅色。生物探針能夠在0～150 mU/mL的濃度范圍內進行ALP檢測，檢測限為0.15 mU/mL，與以前的文獻相比具有突出的優勢。此外，酶殘留物的紅色發射可防止血清樣品的自發熒光干擾。熒光探針還可用于檢測細胞間液中的ALP和相應活細胞的可視化。分子設計策略提供了一個綜合實例，利用天然產物構建具有高靈敏度和聚集狀態的紅色熒光發射的比率熒光探針。

3 結論與展望

本文從AIE的機理出發，闡述了AIE的發光機制，總結了基于AIEgen材料在生物檢測方面的一些最新進展。AIEgens在生物應用方面非常有前途。在熒光生物成像和治療診斷過程中，通過巧妙的生物探針設計，AIEgens的“點亮”適用于識別各種生物分析物，包括核酸、蛋白質和其他大分子，以及細胞內狀態等。此外，如果在這些AIE應用中使用親水設計，也可以實現無洗滌檢測，這對于高精度和高可靠性的生物過程的實時監測具有重要意義。總而言之，AIE材料應用的大門已經打開，更多的應用探究還需要研究者們去繼續探索。