N-烷基化殼聚糖/白芨多糖復合材料制備

郭亮亮，靳寧寧，王瑩，張靜

(鄭州大學 化工與能源學院，河南 鄭州 450001)

殼聚糖價廉易得，止血性[1]、生物相容性良好[2-3]，可廣譜抗菌[4]、促進傷口愈合。殼聚糖經N-烷基化改性后，既保留了其優良活性，又增強了其止血性能[5-7]。白芨多糖是從傳統中藥白芨中提取出的水溶性多糖，可收斂止血、消腫生肌[8-10]，具有多種生理活性[11-13]。離子交聯法在制備殼聚糖復合材料過程中，避免了有毒副作用的交聯劑的使用，是制備止血材料的理想方法[14]。

本文使用離子交聯法制備負載有白芨多糖的N-烷基化殼聚糖凍干粉，以期結合二者的止血性能，利用凍干粉的特性，在達到止血目的的基礎上同時起到一定的止痛作用[15]。

1 實驗部分

1.1試劑與儀器

殼聚糖(CTS)、三聚磷酸鈉、硼氫化鈉、氫氧化鈉、冰乙酸、無水乙醇均為分析純；十二醛(95%)，色譜純；白芨多糖(Bsp，多糖含量50%)，由陜西森弗天然制品有限公司提供；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉均為生物試劑。

SHZ-D(Ш)水循環式真空泵；PHS-25數字pH計；Φ130×60 ZNCL-GS智能磁力攪拌器；DZF-6020真空干燥箱；AB204-N電子分析天平；Nicolet IR300傅里葉變換紅外光譜儀；S-4700場發射掃描電鏡；Nanoplus3 Nanoplus納米粒度與Zeta電位分析儀。

1.2 實驗方法

1.2.1N-烷基化殼聚糖(N-CTS)制備 稱取CTS粉末2 g，配制質量濃度1%的CTS醋酸溶液，靜置除泡備用。將0.55 mL十二醛逐滴加入殼聚糖溶液，攪拌12 h后調節pH=5。配制質量濃度10%的硼氫化鈉水溶液，強攪拌下將硼氫化鈉水溶液逐滴加入反應體系，2 h后調節反應體系pH=7，用無水乙醇反復洗滌抽濾，真空干燥研磨可得N-CTS粉末。

1.2.2N-烷基化殼聚糖/白芨多糖復合材料(N-CTS/Bsp)制備 以質量濃度3%的醋酸溶液為溶劑，配制一定濃度N-CTS醋酸溶液，靜置除泡備用。同樣地，配制一定濃度Bsp醋酸溶液，過濾以除去不溶性雜質。配制1 mg/mL三聚磷酸鈉(TPP)溶液作為交聯劑備用。將N-烷基化殼聚糖溶液與白芨多糖溶液共混，并持續攪拌2 h。調節共混液pH=5，330 r/min轉速下，將TPP溶液逐滴加入到共混液，滴加完成后，保持該轉速一段時間，之后靜置沉淀。將絮狀沉淀離心，除去上層清液，沉淀層冷凍干燥即可得到N-CTS/Bsp。

1.3 N-烷基化殼聚糖的表征

1.3.1 紅外光譜分析 采用KBr壓片法，將N-CTS、CTS粉末與溴化鉀粉末混合研磨壓片，使用紅外分光光度計進行掃描，將二者紅外光譜圖進行對比分析。

1.3.2 元素分析 取N-CTS、CTS粉末，使用掃描電鏡所附帶的X射線能譜元素分析功能對其進行元素分析。分別測量出N-CTS以及CTS中碳、氮兩種元素的分布以及元素百分比，進而計算出N-CTS的取代度。

其中，C/N為測量所得碳氮比，α為殼聚糖的脫乙酰度，SD為N-烷基化殼聚糖的取代度。

1.4 復合凍干粉的表征

1.4.1 紫外光譜測定 取Bsp原料以及所制備的復合凍干粉分散溶于3%乙酸水溶液，形成2 mg/mL的Bsp醋酸溶液以及復合凍干粉醋酸溶液，使用紫外分光光度計研究其紫外吸收情況。

1.4.2 掃描電鏡測定 取所制備的復合凍干粉，首先放入50 ℃恒溫干燥箱進行干燥處理，噴金后使用掃描電鏡對復合凍干粉的形貌進行觀察。

1.4.3 凍干粉粒徑測定 取所制備的復合凍干粉，分散于無水乙醇中，超聲一段時間后靜置，取上清液用納米粒度分析儀對所制備復合凍干粉粒徑分布進行測試分析。

1.5 復合凍干粉的性能研究

1.5.1 吸水性測定 稱取一定質量所制備的凍干粉，于70 ℃烘箱中干燥至恒重，稱重記為W1。將凍干粉置于生理鹽水中，待凍干粉吸水達到平衡，取出凍干粉，將吸水后的凍干粉置于一定坡度玻璃板瀝水，稱取瀝水后凍干粉的重量，記為W2，則凍干粉吸水性(%)可用以下公式計算：

1.5.2 降解性測定 用失重法測定凍干粉的降解性。配制磷酸鹽緩沖液(PBS)，稱取溶菌酶，溶解到PBS溶液中形成降解液(溶菌酶4 mg/mL)。稱取復合凍干粉干燥至恒重，稱重記為M1。取西林瓶編號并稱重記為M2，將凍干粉置于盛有一定體積降解液的西林瓶中，緩慢搖動，使得凍干粉與降解液充分接觸。將西林瓶(含降解液及凍干粉)置于37 ℃恒溫培養箱降解，及時更新西林瓶內的降解液。用去離子水重復洗滌幾次，烘干稱重記為M3。凍干粉的失重率(%)可用以下公式進行計算：

1.5.3 抑菌性測定 采用擴散法測定復合材料的抑菌性。配制復合材料原液，將滅菌后的紙片放入復合材料液，輕微振蕩，使紙片完全沒入材料液內，一段時間后將紙片取出，于超凈工作臺中風干待用。

選取大腸桿菌作為革蘭氏陽性菌代表、金黃色葡萄球菌作為革蘭氏陰性菌代表，配制106CFU/mL的菌懸液，用移液槍轉移200 μL菌懸液到固體培養基，涂布均勻，將負載有復合材料的紙片貼于培養基表面，將培養基置于30 ℃恒溫培養箱培養，一段時間后觀察材料周圍抑菌圈出現情況，對復合止血材料的抑菌性進行評價。

2 結果與討論

2.1 紅外光譜分析

圖1 殼聚糖和N-烷基化殼聚糖紅外光譜

2.2 元素分析

圖2為原料CTS以及烷基化產物N-CTS分子中C、N元素的分布，圖3為每種樣品中C、N元素的占比情況。

圖2 殼聚糖和N-烷基化殼聚糖C、N元素分布

圖3 殼聚糖和N-烷基化殼聚糖C、N元素分析

表1列出了原料CTS以及N-CTS中碳、氮原子百分比，由元素分析，測定了N-烷基化殼聚糖的取代度，同時也進一步證實了烷基醛與殼聚糖成功接枝。

表1 殼聚糖和N-烷基化殼聚糖參數

2.3 紫外光譜分析

由圖4可知，白芨多糖原料醋酸溶液(a)在 259 nm 處取得最大吸光度，在233 nm處取得第二個吸收峰；樣品c(白芨多糖與N-烷基化殼聚糖投料質量比分別為1∶4，b1w4，下同)與樣品b(b3w2)同樣在259 nm處取得最大吸光度，其中樣品b在 232 nm 處取得第二個吸收峰，樣品c在231 nm處取得第二個吸收峰，說明所制備的復合凍干粉成功負載了白芨多糖。此外，樣品中白芨多糖的負載量隨投料比增大而增大。

圖4 白芨多糖、凍干粉紫外光譜

2.4 掃描電鏡分析

圖5與圖6分別為復合凍干粉b1w4與b4w1的掃描電鏡的圖像。圖5中，A與B為b1w4凍干粉放大30 000倍后的形貌，可看出該凍干粉呈現出多孔網絡結構，具有較為豐富的孔道，這為其吸附血液提供了足量的場合及較大表面積；C與D為凍干粉放大10 000倍后的形貌，可以看出，凍干粉表面凸凹不平，這為其與血液中血小板以及血漿蛋白的相互作用提供便利。圖6中，從A到D分別為b4w1凍干粉從放大30 000倍到2 000倍后的形貌。可明顯看出，該凍干粉表面具有大量的突起，分布均勻，且該突起所形成的網絡結構較為豐富，這些突起可能是與N-烷基化殼聚糖復合后的大量白芨所形成。這些突起使得復合凍干粉在與血液接觸后，白芨多糖迅速溶解并參與到凝血過程中，從而加速凝血實現快速凝血成為了可能。此外，大量的突起與孔道結構，也有助于凍干粉可以更好地吸附紅細胞、血小板并與纖維蛋白作用，加速止血。

圖5 b1w4凍干粉掃描電鏡

圖6 b4w1凍干粉掃描電鏡

2.5 凍干粉粒徑分析

由圖7可知，兩種原料比例復合凍干粉的粒徑分布均較為集中，其中b1w4平均粒徑為14.79 μm，b4w1平均粒徑為10.18 μm。b1w4平均粒徑稍大于b4w1，即隨著凍干粉中N-烷基化殼聚糖占比增加，凍干粉粒徑隨之增大。這可能是由于在凍干粉中，N-烷基化殼聚糖比例越高，其與交聯劑交聯所形成的沉淀體積越大，沉淀負載的白芨多糖隨之增加，造成凍干粉粒徑增加。同時可得出，所制備凍干粉粒徑與紅細胞相近。

圖7 凍干粉粒徑分析

2.6 吸水性分析

良好的吸水性，可一定程度上反映出復合材料的血液吸附能力。由圖8可知，隨著白芨多糖添加比例增加，復合凍干粉的吸水率先升高后降低，在w3b2時達到最大值340.2%。這可能是由于當N-CTS占投料比例最高(w4b1)時，所形成沉淀所含N-CTS比例最高，N-CTS與交聯劑所形成的網絡多孔結構具有一定強度，且占沉淀比重較大，凍干粉吸水溶脹受到一定限制，吸水率相對較高；當N-CTS與Bsp的比例為3∶2時，沉淀中N-CTS占比適中，強度較w4b1稍低，該沉淀溶脹性能較高，所含Bsp比例適度，故此時沉淀吸水率最高；在w2b3及w1b4時，沉淀中N-CTS占比較低，沉淀結構較為松散，Bsp雖有一定吸水能力，但此時所負載的Bsp量并未隨著其投料量的增加而明顯增加，所形成的沉淀未能吸附更多的液體，故此時沉淀的吸水性較低。

圖8 凍干粉吸水率隨原料比例變化

2.7 降解性分析

降解性對于生物材料至關重要。復合材料降解過快時，可能造成二次出血等癥狀；復合材料降解過慢則會影響創面的正常愈合。良好的復合材料應具備適宜的降解速率。由圖9可知，各個樣品在第一周降解較為迅速，之后降解速度略微降低，但仍降解較快。其中凍干粉w1b4，即凍干粉中Bsp含量較高時，該凍干粉降解速率最高，四周可降解75%左右，與之相比，凍干粉 w4b1降解稍慢，4周降解近60%。凍干粉在第1周與其之后降解速率的差異，可能是凍干粉內部Bsp易溶解且易降解引起。凍干粉內的白芨多糖具有良好的水溶性，在降解第1周時，大量Bsp溶解進入降解液，被快速降解，加之部分N-CTS同時被降解，故第1周降解速率較之后快。在第2周及之后，大部分Bsp已被降解，雖然N-CTS持續被降解，但其降解速率低于Bsp，故降解速率較之前低。

圖9 凍干粉降解隨原料比例變化

2.8 抑菌性分析

圖10中，A為復合材料對大腸桿菌生長的抑制情況，B為復合材料對金黃色葡萄球菌生長的抑制情況。圖中各紙片負載復合材料質量均為0.1 mg，詳細情況見表2。

圖10 凍干粉抑菌性能

觀察兩種細菌生長情況，由圖10A可知，負載材料的各紙片邊緣處均出現環狀抑菌圈，且抑菌環的寬度(抑菌圈半徑與紙片半徑之差)從1～5逐漸減小，6處抑菌環寬度與3處大致相同；與A類似，B中抑菌環同樣從1～5依次減小，6處抑菌環寬度與3處大致相同。使用游標卡尺量取各個抑菌環寬度，結果見表2。

表2 凍干粉抑菌環寬度

由表2可知，整體來看，復合材料對大腸桿菌的抑制作用強于對金黃色葡萄球菌，且在較高濃度下，復合材料對兩種細菌的抑制作用相差不大，較低濃度時，差異明細。此外，復合材料的抑菌性隨著N-烷基化殼聚糖的含量增加而增強。與大腸桿菌相比，復合材料對金黃色葡萄球菌的抑菌性受N-烷基化殼聚糖的負載量影響較大。復合材料具有與殼聚糖相當的抑菌性，可為接觸部位持續提供無菌環境，可有效避免創面的感染，有利于傷口愈合。

3 結論

以N-CTS、Bsp為原料，通過離子交聯法制備了不同Bsp含量的N-CTS/Bsp復合凍干粉，理化表征及性能表明，Bsp負載量與投料量呈正相關，凍干粉呈三維多孔網絡結構，吸水性較強，從側面顯示出其較強的血液吸收能力，降解速率隨著Bsp比例的增加而加快，抑菌性良好，且抑菌性隨著N-CTS比例增加而增強。綜合考慮各指標，確定凍干粉最佳制備條件為：N-烷基化殼聚糖與白芨多糖比例為4∶1，原料總濃度為2 g/L，N-CTS與交聯劑的正負電荷比為20∶1。在此條件下制備的復合凍干粉具有較高產率89%，良好的吸水性能327%，適宜的降解速率，4周降解59.4%，粒徑分布均勻，平均粒徑 14.79 μm，與血小板大小相近，且N-烷基化殼聚糖占比較高，具備良好的抑菌性，具備作為止血材料使用的巨大潛力。