酸棗葉黃酮的提取工藝優化及其抗秀麗隱桿線蟲氧化損傷活性

孫 艷,崔旭盛,劉 靜,田 賀,楊艷芳,李雅芬,鮑晶晶,李春林,王 輕,張彥青,*,解軍波

(1.天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津 300134;2.石家莊以嶺藥業股份有限公司,河北石家莊 050035;3.天津中醫藥大學中藥學院,天津 301617)

酸棗葉又名棘葉,是鼠李科棗屬植物酸棗(ZiziphusjujubaMill var.spinosa(Bunge)Hu ex H. F. Chow)的葉子[1],具斂瘡解毒之效[2]。酸棗葉中含有豐富的三萜烯酸[3-4]、酚酸[5]、黃酮類化合物[6]及核苷類[7]等成分,具有顯著的抗氧化、抗炎抑菌、抗病毒等多種活性[8-9]。另外,酸棗葉在寧心安神、提高睡眠質量等方面具有其獨到功效,具有“東方睡葉”之美稱[10]。

近年來,酸棗葉除少量藥用和制茶外,主要用于其化學成分的檢測分析,而對有效成分的提取方法和生物活性的研究較少。研究表明,黃酮類成分是酸棗葉中主要的活性成分[11],具有廣泛的生物活性。目前,黃酮類物質的提取方法多是浸提法和加熱回流法[12],但是浸提法提取時間太長,加熱回流法所需溫度太高,有效成分結構容易遭到破壞。近些年來超聲輔助提取技術被廣泛用于提取中藥化學成分[13],展現出了良好的應用前景。

本研究將超聲輔助提取技術和響應面優化方法相結合,建立二項式回歸模型,對影響酸棗葉黃酮提取率的主要因素及其交互作用進行分析探討,優化最佳提取工藝參數。以VC為對照,采用多種體外抗氧化活性方法考察酸棗葉黃酮的抗氧化活性。以秀麗隱桿線蟲為模型,通過考察熱應激抗性、氧化應激抗性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量等方面,深入研究酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲氧化損傷的保護作用,對于綜合開發利用酸棗資源具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗葉 河北邢臺;蘆丁標準品(純度>98%) 北京化學試劑公司;D-101型大孔吸附樹脂 天津市南開大學化工廠;野生型秀麗隱桿線蟲(N2)、大腸桿菌OP50 Caenorhabditis Genetics Center;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所;DPPH、ABTS Sigma-Aldrich;鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸、硫酸亞鐵 天津市福晨化學試劑廠;30%H2O2、DMSO、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、次氯酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉 天津市贏達稀貴化學試劑廠;蛋白陳、瓊脂、酵母粉、氯化鈣、硫酸鎂、膽固醇、5-氟尿嘧啶 北京博奧科技有限公司;實驗中使用的所有試劑 均為分析純。

SB25-12 DTD型數控超聲波清洗器(40 kHz) 寧波新芝生物科技有限公司;V-700型旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司;ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷凍干燥機 德國Marin Christ公司;SpectraMax-M5多功能讀板機 Molecular Devices,USA;DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器有限公司;HNY2102恒溫培養箱 天津市歐諾儀器儀表有限公司;體視顯微鏡 丹東市百特儀器有限公司;VD-650-U超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸棗葉黃酮的提取 酸棗葉干燥(50～60 ℃下干燥至恒重)、粉碎、過40目篩后,按照一定的料液比加入一定濃度的乙醇,然后采用超聲輔助提取法在一定的超聲溫度、一定的超聲功率下超聲一定的時間,提取酸棗葉黃酮,并通過單因素實驗和響應面實驗對提取工藝參數進行優化。

1.2.2 單因素實驗 本研究選擇影響黃酮提取率的液料比、乙醇濃度、提取溫度、超聲功率和超聲時間[14]五個因素進行單因素考察,考察因素與水平如表1所示。

表1 單因素考察因素及水平

1.2.3 響應面優化實驗 在單因素實驗的基礎上,篩選出液料比、乙醇濃度、超聲功率、超聲時間四個影響因素,以這四個因素為自變量,酸棗葉黃酮提取率(Y)為響應值設計響應面實驗[15],優化酸棗葉黃酮提取工藝,并在此基礎上進行驗證實驗。

1.2.4 酸棗葉黃酮提取率的測定 以蘆丁標準品為對照,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[16]測定黃酮含量。以蘆丁含量(mg/mL)為橫坐標,吸光度為縱坐標,得線性回歸方程:y=18.88x-0.006(R2=0.9993),在0.01～0.05 mg/mL范圍內線性關系良好。

所有樣品低速(4000 r/min)離心3 min后,精密吸取上清液0.50 mL于10 mL量瓶中,依法測定吸光度,按標準方程計算提取液中黃酮的濃度,并計算提取率。

式中:C:提取液中黃酮的濃度,mg;N:稀釋倍數;V:提取液體積,mL;W表示樣品重量,mg。

1.2.5 酸棗葉黃酮的分離純化 以最優工藝制備的酸棗葉醇提物為原料,D101型大孔吸附樹脂分離純化[17],依次用純水、20%、50%、70%、95%乙醇溶液洗脫,收集50%乙醇洗脫液,旋轉蒸發濃縮,真空冷凍干燥,得到酸棗葉黃酮粉末。通過紫外檢測法檢測黃酮純度為69.04%,用于后續的抗氧化活性研究。

1.2.6 酸棗葉黃酮體外抗氧化活性實驗 采用鐵氰化鉀還原法[18]測定黃酮的總還原力;DPPH法[19]測定黃酮對DPPH自由基的清除能力;ABTS法[20]測定黃酮對ABTS自由基的清除率;水楊酸法[21]測定黃酮對羥自由基的清除率,并計算半數清除濃度(IC50),VC作為陽性對照。

1.2.7 秀麗隱桿線蟲培養 野生型秀麗隱桿線蟲在20 ℃條件下于NGM固體培養基上培養,并在NGM培養基表面涂布大腸桿菌OP50作為線蟲的食物。采用次氯酸鈉法[22]進行線蟲的同步化,同步化后的線蟲培養至L4期,轉移到含有50、100和200 μg/mL的酸棗葉黃酮的培養基中培養48 h,1‰ DMSO作為對照。

1.2.8 秀麗隱桿線蟲急性氧化應激實驗

1.2.8.1 熱應激實驗 將同步化至L4期的線蟲分別在含有50、100和200 μg/mL酸棗葉黃酮的培養基上培養48 h,1‰ DMSO作為對照。之后用M9緩沖液洗滌3次,轉移到含有1‰ 5-氟尿嘧啶的NGM培養基中,35 ℃恒溫培養[23-24],每2 h記錄線蟲存活數量,直至線蟲全部死亡。

1.2.8.2 H2O2氧化應激實驗 將同步化至L4期的線蟲分別在含有50、100和200 μg/mL酸棗葉黃酮的培養基上培養48 h,1‰ DMSO作為對照。之后用M9緩沖液洗滌3次,轉移到含有1‰ 5-氟尿嘧啶和3% H2O2的NGM培養基中[25],20 ℃恒溫培養,每小時記錄線蟲存活數量,直至線蟲全部死亡。

1.2.9 秀麗隱桿線蟲體內抗氧化酶活力和丙二醛含量測定 將同步化至L4期的線蟲設置兩組,均分別在含有50、100和200 μg/mL酸棗葉黃酮的培養基上培養48 h,1‰ DMSO作為對照。其中一組轉移到35 ℃培養6 h誘導線蟲氧化損傷,一組20 ℃培養6 h,生理鹽水洗滌3次后,加入200 μL生理鹽水冰上勻漿,離心,取上清液[26],根據試劑盒的操作方法測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的活力和丙二醛(MDA)的含量。

1.3 數據處理

所有實驗均重復三次,結果以M±S表示。使用Design-Expert(v8.0)軟件進行中心復合設計和數據處理。Graphpad Prism 5.0進行統計分析,SPSS 16.0進行單向方差分析(ANOVA),其中P<0.05表示有顯著性差異,P<0.01表示極顯著,P<0.001表示高度顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

各因素對酸棗葉黃酮提取率的影響如圖1所示。圖1a中隨著液料比的升高,黃酮提取率呈現先升高后緩慢降低的趨勢,當液料比為30∶1 mL/g時,提取率達到最大值3.39%,這可能是由于料液比在30∶1 mL/g時絕大部分的有效成分已經溶出,繼續增大料液比并不能提高有效成分的溶出率[27]。圖1b可以看出,酸棗葉黃酮提取率隨著乙醇濃度的升高而逐漸升高,當乙醇濃度為50%時,黃酮提取率最大，為3.31%,之后隨著乙醇濃度的升高,黃酮提取率逐漸降低,這可能與黃酮的極性相關,隨著乙醇體積分數的變化,溶劑的極性發生變化,黃酮的提取率隨之改變[28]。圖1d可以看出,隨著超聲功率的增大,酸棗葉細胞壁的破碎程度增大,有效成分更易溶出,所以酸棗葉黃酮的提取率逐漸增大,在300 W時提取率為3.67%,之后超聲功率過大破壞了黃酮的分子結構從而使提取率降低[29]。圖1e可以看出,酸棗葉中的黃酮類成分隨著時間的延長溶出率逐漸增大,黃酮的提取率逐漸增大,在40 min時提取率出現最大值3.68%,之后提取率降低可能是因為長時間的超聲振動導致黃酮的結構遭到破壞,黃酮溶出率降低[30]。由圖1c可以看出,超聲溫度在20～60 ℃范圍內對酸棗葉黃酮提取率無顯著影響。所以選擇液料比(25∶1、30∶1、35∶1 mL/g)、乙醇濃度(70%、80%、90%)、超聲功率(250、300、350 W)和超聲時間(30、40、50 min)這四個因素設計響應面實驗。

圖1 單因素水平對酸棗葉黃酮提取率的影響

2.2 響應面法優化提取工藝

2.2.1 響應面實驗結果與分析 根據表2中的因素與水平值,建立四因素三水平響應面實驗優化提取工藝。響應面實驗設計與結果見表3。

表2 響應面考察因素與水平

表3 響應面實驗設計與結果

2.2.2 方差分析和二次多項回歸方程擬合 由Box-Benhnken實驗擬合出的回歸方程為:

Y=4.38+0.12A-0.12B+3.333E-003C-0.28D+0.18AB-0.098AC+0.073AD+0.12BC+0.087BD-0.055CD-0.30A2-0.63B2-0.57C2-0.18D2

二項式回歸模型系數的顯著性分析結果見表4。A(液料比)對酸棗葉黃酮提取率有極顯著影響(P<0.01),B(乙醇濃度)對酸棗葉黃酮提取率有顯著影響(P<0.05),D(超聲時間)對酸棗葉黃酮提取率有高度顯著影響(P<0.001),C(超聲功率)對酸棗葉黃酮提取率無顯著影響(P>0.05),二次項A2、B2、C2和D2達到高度顯著水平(P<0.001)。各因素的影響重要性依次為:超聲時間(D)>液料比(A)>乙醇濃度(B)>超聲功率(C)。

表4 回歸模型的方差分析結果

2.2.3 因素間的交互效應分析 通過Design-expert.V8.0.6軟件設計三維響應面來反映最佳區域,固定兩個影響因素為中值,代入模型方程考察其余兩個因素間的相互作用[31-32],結果見圖2。

圖2 兩兩因素交互作用對酸棗葉黃酮提取率影響的響應面圖

由圖2可以看出,隨著各因素的水平在一定范圍的增大,酸棗葉黃酮提取率先升高后降低。液料比和乙醇濃度之間的交互作用,乙醇濃度和超聲功率之間的交互作用均對響應值有顯著影響,其余兩兩因素間交互作用對響應值沒有顯著的影響。

2.2.4 最佳提取率驗證 從三維響應面圖中選取Y較理想的區域,求其代碼對應的實際值,結合實際得出最佳提取工藝,由響應面軟件分析得到酸棗葉黃酮最高提取率為4.51%。最佳提取工藝條件為液料比30.25∶1 mL/g、乙醇濃度79.00%、超聲功率301.00 W、超聲時間32.00 min。

在最佳提取工藝條件下提取酸棗葉黃酮,平行實驗三組,測得黃酮提取率為4.21%,與預測值4.51%相比,相對誤差為6.65%,且t檢驗的結果差異不顯著(P>0.05),說明該模型能夠真實反映變量與響應值之間的變化關系。

2.3 酸棗葉黃酮的體外抗氧化作用

由圖3a可知,在100～500 μg/mL內,酸棗葉黃酮的總還原力隨著樣品濃度的升高而增強,其中113.03 μg/mL的酸棗葉黃酮的總還原力與60.00 μg/mL的VC相當,酸棗葉黃酮的總還原力約是VC的0.531倍,具有較強的總還原力;酸棗葉黃酮對DPPH自由基(圖3b)、ABTS自由基(圖3c)、羥自由基(圖3d)均具有清除作用,且存在劑量依賴關系,均呈現出良好的線性關系,由此可計算出酸棗葉黃酮對DPPH自由基的半數清除濃度(IC50)為111.51 μg/mL(VC的IC50為19.61 μg/mL),黃酮清除DPPH自由基的能力約是VC的0.176倍;黃酮對ABTS自由基的半數清除濃度(IC50)為23.06 μg/mL(VC的IC50為15.70 μg/mL),黃酮清除ABTS自由基的能力約是VC的0.681倍;黃酮對羥自由基的半數清除濃度(IC50)為253.73 μg/mL(VC的IC50為53.42 μg/mL),黃酮清除羥自由基的能力約是VC的0.211倍。綜上,酸棗葉黃酮具有良好的抗氧化活性。

圖3 酸棗葉黃酮的體外抗氧化活性

2.4 酸棗葉黃酮抗秀麗隱桿線蟲氧化損傷作用

2.4.1 酸棗葉黃酮抗秀麗隱桿線蟲熱應激作用的影響 如圖4所示,與對照組相比,經過酸棗葉黃酮給藥培養后的N2線蟲的存活率均明顯提高,且存在顯著差異,50、100和200 μg/mL酸棗葉黃酮分別延長線蟲平均壽命11.70%、19.87%、38.95%,說明酸棗葉黃酮能有效提高線蟲對熱應激的抵抗能力。

圖4 酸棗葉黃酮抗秀麗隱桿線蟲熱應激作用的影響

2.4.2 酸棗葉黃酮抗秀麗隱桿線蟲H2O2氧化應激作用的影響 如圖5所示,與對照組相比,酸棗葉黃酮能有效延長H2O2誘導的氧化應激條件下N2線蟲的存活時間,且存在顯著差異,50、100和200 μg/mL酸棗葉黃酮分別延長線蟲平均壽命25.68%、42.82%、51.39%,說明酸棗葉黃酮能顯著增強線蟲對氧化應激的抗性。

圖5 酸棗葉黃酮抗秀麗隱桿線蟲氧化應激作用的影響

2.4.3 酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲體內抗氧化酶活力和丙二醛含量的影響

2.4.3.1 酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲體內GSH-Px酶活力的影響 如圖6所示,給藥組與空白組相比,GSH-Px酶活力不存在顯著性差異,說明酸棗葉黃酮對正常情況下線蟲的GSH-Px酶活力無顯著影響。35 ℃培養6 h后,GSH-Px酶活力顯著降低(40.25%),而50、100和200 μg/mL酸棗葉黃酮均能抑制氧化損傷導致的線蟲體內GSH-Px酶活力減弱,且GSH-Px酶活力分別升高至43.50%、54.39%和75.90%,t-檢驗結果表明100、200 μg/mL酸棗葉黃酮組和對照組之間存在高度顯著差異(P<0.001),酸棗葉黃酮可以有效抑制氧化損傷導致的線蟲體內GSH-Px酶活力降低。

圖6 酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲體內GSH-Px酶活力的影響

2.4.3.2 酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲體內SOD酶活力的影響 如圖7所示,給藥組與空白組相比,T-SOD酶活力和CuZn-SOD酶活力均不存在顯著性差異,說明酸棗葉黃酮對正常情況下線蟲的SOD酶活力無顯著影響。35 ℃培養6 h后,酶活力顯著降低,而酸棗葉黃酮能抑制氧化損傷線蟲體內SOD酶活力的降低,且100 μg/mL酸棗葉黃酮組和對照組之間存在顯著差異(P<0.05),200 μg/mL酸棗葉黃酮組和對照組之間存在高度顯著差異(P<0.001),說明酸棗葉黃酮可以有效抑制氧化損傷導致的線蟲體內SOD酶活力降低。

圖7 酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲體內SOD酶活力的影響

2.4.3.3 酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲體內丙二醛含量的影響 如圖8所示,給藥組與空白組相比,MDA含量不存在顯著性差異,說明酸棗葉黃酮對正常情況下線蟲的MDA含量無顯著影響。35 ℃培養6 h后,MDA含量顯著升高(226.26%),而50、100和200 μg/mL酸棗葉黃酮均能抑制氧化損傷導致的線蟲體內MDA含量升高,且MDA含量分別降低至211.03%、182.05%和156.62%。且100 μg/mL酸棗葉黃酮組和對照組之間存在顯著差異(P<0.05),200 μg/mL酸棗葉黃酮組和對照組之間存在高度顯著差異(P<0.001)。上述結果表明,酸棗葉黃酮可以有效抑制氧化損傷導致的線蟲體內MDA含量的增加。

圖8 酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲體內MDA含量的影響

3 結論

本文采用超聲輔助法提取酸棗葉黃酮,在單因素實驗的基礎上設計響應面實驗,優化酸棗葉黃酮提取工藝,得到最佳提取工藝條件為:液料比30.25∶1 mL/g、乙醇濃度79.00%、超聲功率301.00 W、超聲時間32.00 min。酸棗葉黃酮實際提取率為4.21%,與預測值4.51%擬合效果良好。制得的酸棗葉黃酮對DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基的半數清除濃度(IC50)分別為111.51、23.06和253.73 μg/mL,還原能力較強,具有良好的體外抗氧化活性。酸棗葉黃酮能有效增強秀麗隱桿線蟲對熱應激、H2O2氧化應激的抗性,抑制氧化損傷導致的線蟲體內GSH-Px、SOD酶活力的降低,抑制MDA含量的增加,表現出良好的抗氧化損傷作用,具有廣闊的開發前景。