基于DNA檢測的肉制品鑒偽技術研究進展

龐博文,王勤志,王俊濤,夏 寧,滕建文,韋保耀,黃 麗

(廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004)

肉制品摻假和偽造現象主要有三大類:一是在高值肉類中摻入低值肉,二是以雜交品種肉冒充純種肉,三是使用偽造或錯誤的食品標簽。國際上關于肉類產品標簽錯誤的事件主要是肉制品成分標識不清晰、不準確[1-4]。意大利的加工肉類產品中標簽錯誤率高達57%[1],魚片的標簽錯誤率達42.8%[2]。在美國銷售的肉類產品中標簽錯誤率達35%[3],水產肉類中的蝦和對蝦達24.4%[4]。這些摻假偽造行為多與經濟效益、食品原料和宗教信仰等關系緊密,且往往不易被消費者察覺。此外,某些潛在的未申報物種如不同種類的軟體動物等也可能作為過敏源被摻入摻假肉制品中,這對過敏消費者構成嚴重的健康威脅,故有必要采取科學有效的鑒偽方法。

目前,應用于肉制品鑒偽領域的檢驗技術種類繁多,如早期開發的感觀分析、電泳分析、液相色譜等,也包括逐步發展起來的與PCR相關的技術[5],如qPCR、ddPCR、Multiplex PCR和ISSR-PCR[6]等,還包括ELISA、Bar-HRM、LAMP、RFLP、Microsatellites等。其中qPCR多用于物種鑒定,RFLP多用于肉類品種鑒別,Microsatellites、NGS多用于同時鑒定食品中的動植物種類,HRM多用于傳統肉制品鑒偽,DNA barcoding用于肉制品中摻入植物源物質的鑒別,ddPCR用于肉制品摻假檢驗,LAMP、Multiplex PCR多用于PDO(受保護的原產地名稱)認證,Bar-HRM則多用于肉類物種發源地認證。但有些分析技術因其局限性而無法滿足對當今社會高端造假手段的鑒別[7],故需要對有發展潛力的強勢技術進行更深入的研究。

本文綜述近五年(2014～2019)報道的基于DNA的肉制品鑒偽方法[8],包括食品認證領域內的新興鑒偽技術,也包括沿用至今的經典鑒偽技術,以期為肉制品鑒偽的相關研究提供參考。

1 肉制品鑒偽PCR技術

1.1 PCR鑒定的原理和優缺點

PCR是一種生物體外的聚合鏈式擴增反應,可以在幾小時內通過引物和酶對特定的核酸序列進行數百萬次擴增。常規PCR方法的原理是經PCR擴增特異性片段后,利用瓊脂糖凝膠電泳,觀察電泳后的結果,根據陰陽性或片段大小以鑒定區分不同物種。PCR因具有靈敏度高、特異性強、分析速度快且成本相對較低等優勢,已經成為肉類摻假檢驗領域的常規技術方法,且得到了廣泛的應用。但普通的PCR技術耗時長、操作復雜、成本昂貴且技術要求高,不能滿足肉類市場的管理需求。因而,許多與PCR相關的改良技術被提出。

1.2 PCR相關技術

1.2.1 多重PCR 多重PCR方法是將多個引物對用在一個PCR反應體系中,利用一個模板反應可以得到多個擴增片段,在一次PCR反應中使用基于細胞核DNA和線粒體DNA的多個引物對,可以精確檢測多種物種成分。故其被廣泛應用于食品中存在的物種的檢測和分化[9]。

多重PCR分析可通過使用物種特異性引物同時鑒定多個物種,在進行靈敏的定性測定時,通常選擇具有高細胞拷貝數的線粒體DNA。盡管PCR測定的可用性在很大程度上取決于目標DNA的質量和數量,但通過使用熱循環儀對目標DNA分子的指數擴增,可產生高達數百萬的擴增量,并可檢測到復雜基質中濃度極低的目標物。目前已經開發了針對線粒體區域的多重PCR測定,以同時檢測肉中的不同動物物種,檢測靈敏度低至1 pg DNA[10-13]。此外,在摻假的肉丸中可識別出低至0.1%的狗、大鼠和兔肉[14-15]。然而,由于每個細胞的拷貝數在同一個體內的物種、個體甚至組織之間發生變化,使得線粒體基因不適合量化。因此,在需要量化以確保食品真實性的情況下,選用核基因更為合適[16]。

多重PCR技術既繼承了常規PCR的優點,又可以在同一次反應中檢測多個物種,大大節約了實驗成本。但多重PCR技術也存在不足之處,其檢測重數越多,效率一致性往往越低。針對MPCR擴增效率一致性的問題,傳統單管多靶標擴增的方式通過不斷優化反應體系中緩沖液、酶、引物、探針等的用量,確保每一重的擴增效率保持一致,然而隨著檢測重數的增加,形成二聚體甚至多聚體的可能性也大幅上升,輕則導致非特異性擴增的出現,靶標擴增效率下降,檢測靈敏度和特異性降低,重則導致非特異性擴增占據主導,靶標擴增失敗,造成假陽性和/或假陰性,影響檢測準確性[17]。

1.2.2 qPCR qPCR是在常規的PCR體系中添加熒光基團,利用機器監測熒光信號的變化,可以實時監控PCR反應過程,以實現對樣品的定性和相對定量。在物種鑒別中,qPCR是比較先進的技術,結果直觀易觀察,避免了瓊脂糖凝膠電泳中的污染問題。

qPCR在靈敏度、多路復用、分析速度和成本方面超過了傳統技術,是混合食品中摻假定量評估的首選方法。qPCR檢測中核酸被擴增,并通過實時監控測量來自雙鏈DNA結合染料釋放的熒光,其可在每個PCR循環中測量[18]。已有研究表明,用qPCR可同時檢測野味肉中的不同動物物種,例如有學者檢測出了四種不同鹿肉的具體含量[19-22]。同樣,qPCR被用來檢驗原料和加工清真產品中是否存在禁用的肉類(如豬肉)[23-24]。關于海產品,最近已采用qPCR系統專門檢測金槍魚產品的欺詐或錯誤標簽[25]。

多重qPCR也被用來檢測乳制品的欺詐和錯誤標簽現象[26-28]。李志娟等[29]根據甲魚線粒體細胞色素b基因中的保守區域設計甲魚特異性引物及Taq Man探針,用RT-qPCR方法檢測出市售假冒甲魚肉的存在,最低檢出濃度為0.005 ng/μL,且與其他肉源性成分均無交叉反應。因為靶DNA區域具有高特異性,故可在低濃度下對肉制品中某些物種進行定性檢測,但不同的加工方式生產出來的肉制品(如加熱溫度不同)對PCR效率和精度有影響,使得絕對或相對量化具有一定局限性[30]。

1.2.3 數字PCR 數字PCR(ddPCR)從概念提出到商業化生產在短短幾十年間經歷了飛速發展。根據分液方式的不同,數字PCR主要分為微孔板數字PCR、微滴數字PCR以及芯片數字PCR。最初,分配分子模板是在96/384孔微孔板中進行,面對復雜的樣品仍采用手動稀釋加樣方法,會帶來巨大加樣誤差。由于數字PCR技術的準確程度取決于反映單元的總數,即反映單元數目越多,越有利于數字PCR的準確度。因此,96/384孔板也無法滿足反應需要[31]。其中,ddPCR包括將擴增反應大量分配成納升大小的樣品,其被包封成油滴,以便在每個單獨的液滴上進行一次PCR[32]。ddPCR在靈敏度與精密度方面均優于qPCR,且無需制作標準曲線即可測量靶DNA含量,該技術已成功應用于肉制品的鑒偽和定量[33]。

1.2.4 其他PCR鑒定方法 食品控制和真實性領域研究的主要目標是開發出一種可即時對食品進行分析的技術。為此,基于PCR的方法與其它技術(如微流體、生物傳感器或納米技術)的結合已經引起了現場應用領域學者們的興趣。

Furutani等[34]使用便攜式qPCR系統,在20 min內成功實現了對加工食品中牛肉、豬肉、雞肉、兔肉、馬肉和羊肉的準確鑒定。Lin等[35]報道了一種基于物種特異性探針的方法,該探針靶向細胞色素c氧化酶亞基1基因(COI)結合流通雜交檢測,用于多種肉類的鑒定(多重鑒定),因為該測定快速且相對便宜,所以適合常規測試用。Wang等[36]描述了一種光學-薄膜-生物傳感器測試,該測試可以通過肉眼可感知的顏色變化監測和區分多達八種肉類,檢測限低至0.001%。Kitpipit等[37]提到了一種可通過PCR擴增,直接在樣品上檢測六種常見肉類的方法,該方法可減少樣品前處理。在另一項研究中,有學者使用基于cytb基因對流Palm PCR的超快速方法鑒定肉類,該方法具有很高的現場應用潛力[38],與標準PCR相比,該方法避免了反應在不同溫度間的驟然變化,可使用單重或多重程序在24 min內完成對目標物種的檢測,可檢測摻假量低至1%的肉制品。Taboada等[39]開發了一種物種特異性四鏈體PCR系統,并通過側流式試紙(LFD)進行檢測,以便在海產品中對兩種鱈魚物種進行原位篩選。LFD因其具有便攜性和簡單性,且可對結果進行肉眼監測,而被證明有很強的實用性。據報道,在這種情況下使用基于凝膠的擴增產物檢測的類似多重PCR檢測方法可區分五種可食用或潛在可食用的水母物種[40]。

近五年來,與PCR相關的技術應用于肉制品鑒偽領域的代表性研究如表1所示。

表1 PCR相關的肉制品鑒偽技術

續表

2 DNA條碼

DNA條形碼由測序和比較直系同源DNA區域組成,用于分類鑒定,是目前用于活體動物生源地鑒定的標準化方法[41]。目前,在動物研究中,基于線粒體細胞色素c的基因,通過使用短的標準DNA片段對物種進行精準識別和高效鑒定的方法已被廣泛應用[42]。DNA條形碼,通過使用傳統的Sanger DNA測序儀或NGS技術,有效推動了食品種類鑒定和可追溯性方面的進步[43]。DNA條形碼技術的難點在于找到某種理想的目標基因,這種基因在某個分類群中呈現低變異性,但具有高水平的物種間變異性。因此,檢測幾個物種中的保守區域可達到區分物種的目的。用于區分物種的較有針對性的基因是COI、細胞色素b基因(cytb)和用于動物物種鑒別的maturase K(matK)基因。這些基因相比線粒體和質體DNA的優勢在于其在細胞中存在較高數量的復制體,這也使其成為大多數定性方法中的目標基因,其中需注意的是要用高靈敏度的方法來檢測低濃度的相應物種的目標基因[16]。由于DNA的降解,在中等或高度加工和保存的產品中對于標準長度(約650 bp)條形碼的PCR擴增是具有難度的。然而,專注于較短DNA片段(100～200 bp)的小型條碼編碼方法已通過魚類產品認證測試,成功率達到93%(使用標準長度條碼時為20.5%)[44]。

學者投入了大量精力創建了全球生命數據系統(BOLD),為幾乎所有生物創建了條形碼公共數據庫。與肉類相比,可食用海產品和植物的多樣性更高,因此要區別相似的個體是具有難度的,特別是在加工食品中。在許多情況下,條形碼分析可以檢測到低百分比的錯誤標記,但由于物種的高度相似性,有時難以判斷欺詐是故意的還是無意的。此外,為了區分和識別不同魚類,目前已建立了包含所有魚類的標準化參考序列的魚類生命條形碼倡議(FISH-BOL)公共資料庫。如今,DNA條形碼技術已成功應用于包括新鮮、冷凍和其它加工產品在內的海產品的欺詐和錯誤標簽檢測[45-51]。

3 新型鑒偽技術

3.1 高通量測序

近年來,DNA條形碼方法已被整合到高通量測序格式(原為下一代測序,NGS)中,證明了其具有同時鑒定食品中動物和植物物種的高潛力。NGS對基因組研究產生了變革性的影響,其能夠并行地對數百萬個小DNA片段進行測序[52],且因NGS可進行實時檢測,省去了反應的后續步驟,故其比Sanger測序速度更快,通量更高。近年,DNA條形碼和焦磷酸測序技術的結合已成功用于魚類、海產品[53-55]、肉及肉制品[56]的鑒定中。同樣,可以在乳制品中檢測到包括未申報物種和人類DNA在內的其它動物物種來源[57]。

3.2 高分辨率熔解曲線分析其及延伸技術

高分辨率熔解曲線技術(HRM)是一種快速、高通量的技術,其可根據反映遺傳變異的特定DNA擴增子的解鏈溫度(Tm)進行基因分型和序列匹配(以及因此對分類群的區分)[58]。這種在PCR后使用熒光嵌入DNA染料的方法,當溫度升高時,可以監測dsDNA變性情況。HRM的分辨能力依賴于序列分歧,因此,即使少數堿基對差異也會改變熔解曲線,所以當被分析的DNA序列相似度極高時,要區分不同物種是比較困難的。HRM可同時檢測多達8種不同的肉類動物,檢出限為0.1 ng DNA。在一項涉及蜂蜜的昆蟲學鑒定的研究中,有學者通過分析蜂蜜樣品成功鑒定出了蜜蜂物種[59]。

2010年開發的另一種方法是HRM與DNA條形碼的組合,稱為Bar-HRM,當用于物種和亞種分化時,它有很大的潛力。該方法包括基于來自條形碼標記的序列設計HRM特異性引物。與DNA條形碼技術相比,Bar-HRM的優勢在于可以實現定量測量,且其具有比傳統熔解曲線分析更高的分辨率[60]。據報道,有學者用Bar-HRM區分了五種最具商業價值的蝦類,其鑒定精度達到99%以上[61]。另有學者采用相同的方法區分了五種鱈魚(高價值且易被摻假)[62]。

3.3 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術(LAMP)是日本學者Notomi在2000年提出的一種適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術,該技術已被用于食品認證領域。與PCR和qPCR一樣,LAMP也可以檢測特定的DNA序列,且可以測定多達八種不同的靶向序列。LAMP方法使用自我重復的鏈置換DNA合成,在恒定溫度下復制靶DNA,并避免了PCR擴增的冗長步驟[63]。

在關于清真食品的評估中,qLAMP以及針對豬肉特異性DNA的LAMP和電化學發光(ECL)傳感器的組合已經可以檢測出含量低至0.01%的牛肉、豬肉和0.1 pg/μL的豬肉DNA[64-65]。LAMP-ECL傳感器除了具有高靈敏度外,還可以用作緊湊、簡單、快速(約5 min檢測)的生物傳感器,可用于現場食品認證評估。有學者使用LAMP方法同時檢測了八種不同肉類[66]。在現場應用方面,將特定的LAMP反應與LFD組合可開發出能夠檢測低至10 pg哺乳動物物種DNA的快速測試生物傳感器[67]。

LAMP技術不需要進行反復熱循環擴增,避免了反復升降溫的耗時過程,可實現恒溫條件下的快速擴增,彌補了傳統PCR反應的缺點。其通過加入熒光染料或熒光基團,利用目視比色或儀器法確定檢測結果,能較好地檢測出肉制品中的摻假情況。

4 經典DNA標記

廣泛用于群體遺傳學研究的經典DNA標記技術,如微衛星、RAPD、擴增片段長度多態性(AFLPs)、RFLP、序列特征擴增區域和(最近)單核苷酸多態性(SNP)已被證實在肉制品鑒偽領域非常實用[2,68-69]。現多將其中的某幾種技術結合起來使用,如RFLP結合PCR也是一種基于DNA的分析方法,通常可用于食品的物種鑒定中。然而,這些技術相比于DNA條碼技術,其靈敏度和選擇性低,且操作更為繁瑣。目前,PCR-RFLP已被廣泛用于鑒定海產品中摻雜的物種,并且該技術也適用于肉制品鑒偽。在RFLP中,經PCR擴增后,使用酶消化靶DNA,并通過凝膠電泳監測所得的限制性圖譜,即可通過比較不同樣品的圖譜來鑒別物種[70]。董傳舉等[71]通過PCR-RFLP技術,使用一組引物分別對8種鱘魚線粒體基因進行PCR擴增,并分別應用限制性內切酶TaqαI、Ava II和Eag I-HF、Nae I對擴增產物進行酶切,使用3.0%的瓊脂糖凝膠檢測其酶切結果,在保證魚種存活基礎上僅剪取少量魚鰭,便快速準確地鑒別出了8種鱘魚易混種中的中華鱘、小體鱘、達氏鰉以及歐鰉。韓鐫竹等[72]以純羊肉為原料,按2%、5%和10%的重量比在羊肉中摻雜雞肉、豬肉和鼠肉,通過基因組DNA提取試劑盒法提取DNA,并采用PCR-RFLP技術成功的同時檢測出羊肉中的摻雜肉類,檢出限為2%。Subbiah等[73]使用PCR-RFLP技術對收集到的來自全國各地的樣本中的肉類進行了溯源性檢測,并利用物種特異性PCR鑒定了肉牛和水牛樣品,在112份樣本中,鑒定出7.14%的雌性牛和56.25%的雄性牛,并檢測出有11個樣品為水牛和肉牛,有2個綿羊肉、1個山羊肉和2個雞肉樣品,此外還發現樣品中有駱駝肉的存在。Sunutcha等[74]基于PCR-RFLP技術,測定了細胞色素b、12S和16S rRNA的PCR產物序列,并用Alu I和Hinf I兩種不同的限制性內切酶進行切割,成功的檢測并區分出泰國海域海蛇的血液、蛇皮、生肉、熟肉、海蛇-魚二元混合肉和海蛇-豬二元混合肉,該技術可應用于海蛇肉制品市場的摻偽鑒別,且對于追蹤海蛇物種被捕獲的時間和評估泰國水域海蛇的保護和管理有重要意義。有學者通過靶向線粒體區域的PCR-RFLP區分了5種金槍魚種類、9種不同的鯛魚種類和16種商業海參種類[75-77]。RFLP方法也被用于檢測混合物和肉丸中含量低至0.01%的貓肉[78]。盡管是最常用的技術之一,RFLP分析和其他經典DNA標記技術的使用也未必能獲得可靠的定量信息。此外,因為分析基于可以與參考樣品比較的指紋樣擴增模式,所以它們難以標準化。

SNP是單個位置的DNA序列變異,其已被證明在人類疾病的診斷中非常有用。SNP分析可以區分那些親緣關系很近的樣本[79],因為分析側重于單核苷酸變化而不是整個序列,所以該方法特別適用于鑒定相似度高的品種[80]。表2匯編了使用這些經典DNA標記進行食品認證的最新研究。

表2 經典DNA標記物在食品鑒偽方面的應用

5 結論與展望

對于肉制品的鑒偽方法,其首先必須滿足準確和可靠的要求。此外,由于高度分散的靶DNA分子間的差異性很小,且十分敏感,因此,鑒偽方法還應具有高度特異性。同時,鑒偽方法應具有高通量能力、分析時間短的特點,以便快速的檢測出摻假成分。目前開發的鑒偽技術如NGS、DNA-metabarcoding、Bar-HRM、LAMP和ddPCR等已經超越了傳統的鑒偽方法。

目前,納米粒子已經被納入食品應用,例如過敏原和有毒化合物的檢測[81-82]以及食品安全認證[83]。而采用微流體裝置和納米粒子,改進了復雜食品基質DNA的回收和提取過程[84-85],為肉制品鑒偽技術的進一步發展提供了技術支持。在未來的鑒偽技術中,把數字PCR和LAMP等技術與微流體和納米流體系統以及新型納米生物傳感器系統結合,將會顯著提高這些基于DNA的鑒偽方法的效力[86-88]。基于納米粒子的生物傳感器,由于可實現大規模的平行試驗,且具有便攜式分析平臺,省去了傳統方法中樣品制備的繁瑣操作,也將會成為今后的重要研究趨勢之一。