謝村黃酒的雙酶法發酵工藝優化

韓惠敏,耿敬章,2,3,李新生,2,3,*,裴金金,2,3,楊 佳,吳東平

(1.陜西理工大學生物科學與工程學院,陜西漢中 723000;2.陜西省資源生物重點實驗室,陜西漢中 723000;3.中國謝村北派黃酒研究院,陜西漢中 723000;4.陜西省秦洋長生酒業有限公司,陜西漢中 723300)

黑米為禾本科植物,可分為黑糯米和黑粘米兩種[1]。黑米色香味俱全且含有多種營養成分,胚芽和種皮是其大部分養分聚集的部位[2]。黑米色素是存在于黑米種皮中的一類天然黃酮類色素,與合成色素相比安全性高且具有較高的營養價值和藥理活性[3]。功能性黑米保健食品成為當今的研究熱門,黑米果茶、黑米雙歧酸奶、黑米黃酒等新成果不斷出現[4-5]。

黃酒是世界上最為古老的酒種之一,傳統黃酒根據其釀造原料與生產地域的不同,可分為南方黃酒及北方黃酒[6],謝村黃酒是北方黃酒的代表性產品。目前,謝村黃酒的生產主要以傳統手工釀造為主,具有生產周期長且勞動強度大等特點。此外,黃酒傳統釀造工序中,“浸米-蒸飯”使得原料米中的生理活性成份流失,同時也降低了單位原料米的黃酒產率[7]。對此,研究者們開發了擠壓膨化法、焙炒法、液化法及生料法來替代傳統“浸米-蒸飯”工序,且部分已進行應用[8-11]。據文獻報道,目前黑米黃酒的釀造工藝以浸米、蒸飯、大曲傳統黃酒發酵;原料經生物酶糖化后采用純菌種進行液態發酵;原料米經糖化、純菌種固液二次連續發酵為主[12-15]。但仍存在一些問題亟需解決,如浸米工序使生理活性物質花青苷大量損失,酒體中黑米色素不穩定等。

本研究以黑糯米為釀造原料,以“焙炒”替代傳統“浸米-蒸飯”工序,在發酵過程中,采用雙酶液化糖化后,接入傳統謝村麥曲進行發酵。通過單因素實驗聯合正交實驗優化黑米黃酒的最佳釀造工藝。旨在為深入開發具有更好保健作用的新型謝村黃酒做前期研究,同時進一步健全我國北派黃酒研究體系,為我國黃酒釀造提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米 洋縣周大黑;麥曲 陜西省秦洋長生酒業有限公司;高溫α-淀粉酶(食品級,40000 U·g-1)、糖化酶(食品級,100000 U·g-1) 北京索萊寶科技有限公司;濃硫酸、氯化鉀、乙酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、亞硫酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖 分析純,天津市盛奧化學試劑有限公司。

BD-chj100型自動恒溫控溫電加熱炒貨機 廣州市旭朗機械設備有限公司;CLF-06C型高速粉碎機 浙江省溫嶺市藥材器械廠;ZA220R4型電子天平 上海贊維衡器有限公司;DK-98-II A型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;3FG-01B型電熱恒溫干燥箱 湖北省黃石市醫療器械廠;DT5-1型低速臺式離心機 湘儀離心機儀器有限公司;UV-1750型紫外可見分光光度計 日本島津有限公司;RP-300B型人工氣候箱 南京恒裕電子儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 釀造工藝流程 挑選有光澤、顆粒飽滿的黑米,篩選除雜、清洗干凈后。潤麥調節水分至30%,平衡24 h后,在220～240 ℃下炒制30 min,室溫冷卻干燥12 h。粉碎機粉碎至可過60目篩,備用。

釀造工藝:黑米→焙炒→粉碎→液化→糖化→發酵→過濾→酒液。

1.2.2 黑米黃酒液化工藝的優化

1.2.2.1 液化工藝單因素實驗 液化工藝程度是液化法釀制黃酒過程中的關鍵因素,在醪液液化過程中,直鏈淀粉在酶的作用下逐步分解為還原糖,以供后期酵母發酵利用[11]。醪液pH、液化溫度、高溫α-淀粉酶的添加量以及液化時間是影響液化程度的幾個關鍵因素,預實驗發現所采用的高溫α-淀粉酶在pH為6時酶活最強,故選取液化溫度、高溫α-淀粉酶的添加量以及液化時間三個因素對黑米黃酒液化工藝進行優化。參考文獻[16-18]的實驗方法并稍做修改,對黑米黃酒液化工藝進行優化。稱取50 g經過預處理的黑米粉,以1∶3 g/mL的料液比進行混勻,以液化溫度80、85、90、95、100、105 ℃;液化時間10、20、30、40、50、60 min;高溫α-淀粉酶添加量10、20、30、40、50、60 U·g-1為單因素條件依次優化黑米黃酒液化處理。其中各因素固定水平為料液比為液化溫度85 ℃,液化時間50 min,高溫α-淀粉酶添加量為50 U·g-1。液化完成后,以4500 r/min離心10 min,吸取上清液,測定葡萄糖值(DE值)。

1.2.2.2 液化工藝正交實驗 根據單因素實驗所確定的最適水平范圍,采用SPSS 19.0設計方案,以液化溫度、液化時間與高溫α-淀粉酶添加量為因素,設計L9(34)正交表,以DE值為指標確定最優液化工藝條件組合,因素水平如表1所示。

表1 L9(34)正交試驗因素與水平

1.2.3 黑米黃酒糖化工藝的優化

1.2.3.1 糖化工藝單因素實驗 醪液經液化處理后進行糖化工藝的優化。參考文獻[16-18]的實驗方法并稍做修改,對黑米黃酒糖化工藝進行優化。以糖化溫度50、55、60、65、70、75 ℃;糖化時間60、90、120、150、180、240 min;糖化酶添加量50、60、70、80、90、100 U·g-1為單因素條件依次優化黑米黃酒糖化處理。其中各因素固定水平為料液比為糖化溫度75 ℃,糖化時間150 min,糖化酶添加量為70 U·g-1。糖化完成后,以4500 r/min離心10 min,吸取上清液,測定葡萄糖值(DE值)。

1.2.3.2 糖化工藝正交實驗 根據單因素實驗所確定的最適水平范圍,選擇糖化時間、糖化溫度與糖化酶添加量為因素,設計L9(34)正交表,以DE值為指標確定最優糖化工藝條件組合,因素水平如表2所示。

表2 L9(34)正交試驗因素與水平

1.2.4 黑米黃酒主酵工藝的優化

1.2.4.1 主酵工藝單因素實驗 參考王元軍等[19-21]的實驗方法并稍做修改,對黑米黃酒主酵工藝進行優化。醪液以最優液化工藝、糖化工藝處理完成后,以料液比1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0 g/mL;主酵溫度16、20、24、27、30、34 ℃;接曲量0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%為單因素條件,在30 ℃下發酵4 d。其中各因素固定水平為料液比為1∶2.5 g/mL,主酵溫度為30 ℃,酒曲添加量為0.25%,酵母添加量為0.25%。發酵完成后,以4500 r/min離心10 min,吸取上清液,測定酒精度與花青苷含量。

1.2.4.2 主酵工藝正交實驗 根據單因素實驗所確定的最適水平范圍,設計L9(34)正交表,以酒精度與花青苷含量為指標確定最優主酵工藝條件組合,因素水平如表3所示。

表3 L9(34)正交試驗因素與水平

1.2.5 測定分析方法

1.2.5.1 DE值的測定 DE值在工業上可表示淀粉的水解或糖化程度[22]。計算公式如下:

DE(%)=(水解后還原糖含量(mg/mL)-水解前還原糖含量(mg/mL))/總固形物含量(mg/mL)×100

還原糖含量的測定參照趙凱等[23]的實驗方法并略作修改。準確稱取1.000 g烘干至恒重的葡萄糖,用蒸餾水定容到1 L容量瓶中,配置成1 mg/mL的葡萄糖母液。從母液中分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL容量瓶中,加入7.5 mL DNS試劑,用蒸餾水定容至10 mL,充分混勻后沸水浴5 min,流水冷卻后取2 mL于10 mL試管中,加入4 mL蒸餾水混勻,于540 nm下測定吸光度。

標準曲線方程為y=1.861x+0.000619(R2=0.9998),其中x為體積(mL),y為吸光度值。

樣品測定時吸取0.5 mL樣品,加入1.5 mL DNS試劑,沸水浴5 min,流水冷卻,蒸餾水定容至10 mL,顯色定容30 min后,于550 nm處測定波長。

固形物含量的測定采用105 ℃恒重法[24]。

1.2.5.2 黃酒基本理化指標的測定 總酸、總糖、酒精度、氨基酸態氮的測定參考文獻[24]的方法。

1.2.5.3 花青苷含量測定 采用雙波長pH示差法[25],吸取1 mL酒液于9 mL pH=1的緩沖液中,進行全波長掃描,確定花青苷的最大(520 nm)及最小(700 nm)吸收波長。樣品測量時,吸取1 mL以蒸餾水稀釋40倍后樣品于10 mL容量瓶中,用pH=1與pH=4.5的緩沖液定容至10 mL。空白組與樣品處理方式相同;在40 ℃下平衡20 min后,分別于520、700 nm下測量。計算公式如下:

A=[(A520-A700)]pH1-[(A520-A700)]pH4.5

式中:C:花青苷含量(mg/L,以矢車菊素-3-葡萄糖苷計);A:吸光度;ε-矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(29600 L·mol-1·cm-1);DF:待測樣酒稀釋倍數;Mw:矢車菊花素-3-葡萄糖苷的相對分子質量(449.2 g/mol);L-光路長(1 cm)。

1.3 數據處理

每個樣品設置三組平行實驗,采用SPSS 19.0設計正交實驗同時對數據進行處理分析,繪圖由Graphpad Prism 7.0完成。

2 結果與分析

2.1 黑米黃酒最佳液化工藝條件的確定

2.1.1 液化工藝單因素實驗結果 醪液液化程度可由DE(葡萄糖當量)值進行評判,顏懷偉[26]研究發現,當醪液DE值控制于15%～20%左右時,有利于后續工序(液化與發酵)的進行。液化溫度、液化時間以及高溫α-淀粉酶的添加量對液化程度的影響如圖1所示。

圖1 液化溫度、時間及酶添加量對液化程度的影響

液化溫度對醪液DE值的影響如圖1A所示,隨著液化溫度的升高,醪液DE值呈現先上升后下降的趨勢。當液化溫度為85 ℃時DE值達到峰值,而繼續提升液化溫度,DE值則開始下降,在105 ℃時DE值最低,說明隨著液化溫度的升高,高溫α-淀粉酶開始失活,導致醪液中水解后還原糖含量下降。因此,在此反應體系中最適液化溫度區間在80～90 ℃。

圖1B中可看出液化時間對醪液DE值有顯著影響,隨著液化過程中酶解的進行,DE值上升很快。在40 min時開始趨于平緩,50 min后則開始呈現下降趨勢。這是因為在一定時間內,淀粉在酶的作用下開始水解,而液化時間過長后,酶含量被消耗到一定程度,同時逐漸增多的酶分解物也不利于反應的進行,此時醪液中還原糖含量達到定值,而干物質含量則仍處于上升趨勢,因此過長的液化時間會使DE值下降。故液化時間范圍選為40～60 min。

由圖1C可知,當酶添加量小于50 U·g-1時,隨著酶添加量的增加,DE值不斷上升,之后則趨于下降。從生產成本與酶解效果兩方面綜合考慮,高溫α-淀粉酶最優添加量在40～60 U·g-1，

2.1.2 液化正交實驗結果 結果如表4、表5所示,3個單因素對液化程度影響的主次順序為C(高溫α-淀粉酶添加量)>A(液化溫度)>B(液化時間),由方差分析可以看出,高溫α-淀粉酶添加量對DE值影響最為顯著(P<0.05),液化溫度與液化時間兩因素影響均不顯著(P>0.05)。由正交試驗所得出的最佳組合為A2B2C3,即液化溫度為85 ℃,液化時間為50 min,高溫α-淀粉酶添加量為50 U·g-1,在該組合條件下DE值可達19.77%±0.0360%。

表5 液化正交試驗結果方差分析

表4 液化L9(34)正交試驗結果

2.2 黑米黃酒最佳糖化工藝條件的確定

2.2.1 糖化工藝單因素實驗結果 糖化工藝是為了進一步提高醪液中的還原糖含量,醪液的糖度水平與酵母菌的增殖發酵相關。糖化溫度、糖化時間與糖化酶添加量是控制糖化過程的幾個關鍵因素,以DE值為參考通過單因素實驗優化醪液糖化工藝。三個因素與醪液DE值的關系如圖2所示。

圖2 糖化溫度、時間及酶添加量對糖化程度的影響

由圖2A可知,糖化溫度在50～70 ℃范圍內,DE值隨著溫度的升高而逐漸增大,當溫度為70 ℃時,DE值達到最大值;隨著溫度的進一步升高,DE值開始下降。這是由于過高的溫度使糖化酶開始失活,綜合考慮,醪液的最適糖化溫度應為60～80 ℃范圍內。

糖化時間與DE值的關系如圖2B所示,DE值隨糖化時間的延長而增大,當糖化時間大于180 min時,DE值的增長開始趨于平緩,為保證糖化質量且節約時間成本,選擇糖化時間在150～240 min范圍內進行正交實驗。

糖化酶添加量與醪液DE值的關系如圖2C所示,當糖化酶添加量為50～80 U·g-1時,醪液的DE值不斷上升且增速較快;而當添加量大于80 U·g-1時,醪液DE值增速開始趨于平緩。因此,最適糖化酶添加量應在70～90 U·g-1之間。

2.2.2 糖化工藝正交實驗結果 結果如表6、表7所示,3個因素對糖化程度影響的主次順序為A(糖化溫度)>C(糖化酶添加量)>B(糖化時間),由方差分析可以看出,糖化溫度對DE值影響最為顯著(P<0.05),其次為糖化酶添加量,糖化時間對DE值影響不顯著(P>0.05)。由正交試驗所得出的最佳組合為A2B1C1,即糖化溫度為70 ℃,糖化時間為150 min,糖化酶添加量為70 U·g-1,該組合并未出現于實驗組中,補充實驗后該組合DE值可達68.15%±0.0264%,確定為最優糖化工藝。

表7 糖化正交試驗結果方差分析

表6 糖化L9(34)正交試驗結果

2.3 黑米黃酒最佳主酵工藝條件的確定

2.3.1 主酵工藝單因素實驗結果 經最佳液化工藝、糖化工藝處理后,以酒精度與花青苷含量為指標,從料液比、主酵溫度與酒曲添加量三因素優化黑米黃酒主酵工藝。料液比、主酵溫度與酒曲添加量對主酵工藝的影響如圖3所示。

圖3 料液比、主酵溫度及曲添加量對發酵程度的影響

由圖3A可知,料液比對花青苷含量與酒精度的影響趨勢一致,當料液比處于1∶1.5～1∶3之間時,酒精度呈上升趨勢,在料液比為1∶3時,酒精度達到最大值;繼續加大料液比后,酒精度與花青苷含量均呈現下降趨勢。在料液比較小時,由于發酵程度較低,導致還原糖未被進一步轉換為酒精,因此酒精度也很低,此時原料中的有效成分物質花青苷也未被充分浸漬于酒體中;而當料液比過高時,稀釋作用則影響了酒體的酒精度[27]。因此,選擇料液比為1∶2.5～1∶3.5 g/mL進行正交實驗。

主酵溫度對酒精度與花青苷含量的影響如圖3B所示,當主酵溫度低于30 ℃時,酒體中花青苷含量與酒精度隨溫度上升而增加,當溫度超過30 ℃后,花青苷含量與酒精度則開始下降。這是因為在低溫條件下,酵母菌增殖緩慢,對還原糖的利用度也較低;當溫度過高時,酵母菌由于增殖速度過快而老化,影響了酒體的酒精度。酒體中的花青苷含量易受主酵溫度與酒精度影響為20～40 ℃。

由圖3C可得,當酒曲添加量為0.25%時,酒精度與花青苷含量達到最大值,過高或過低時均會使酒體質量下降。故在后續正交實驗因素中酒曲添加量范圍定為0.20%～0.30%。

2.3.2 主酵工藝正交實驗結果 由表8、表9可知,3個因素對主酵程度影響的主次順序為C(酒曲添加量)>B(主酵溫度)>A(料液比),由方差分析可以看出,酒曲添加量對DE值影響最為顯著,其次為主酵溫度(P<0.05),料液比影響不顯著(P>0.05)。由正交試驗所得出的最佳組合為A1B2C2,即料液比為1∶2.5 g/mL,主酵溫度為30 ℃,酒曲添加量為0.25%,此時,酒體酒精度為9.8%vol,花青苷含量為(298.32±0.02) mg/L,確定為最優主酵工藝。

表9 主酵正交試驗結果方差分析

表8 主酵L9(34)正交試驗結果

2.4 最佳工藝條件下黃酒品質檢測

在最佳液化、糖化、釀造工藝條件處理后,以20 ℃后發酵30 d,對壓榨所得酒體進行品質檢驗,各項指標均合格,檢驗結果如表10所示。

表10 最佳工藝條件下黑米黃酒品質指標

3 結論

本研究首先以DE值為量化評價指標,采用單因素實驗與正交實驗優化確定了雙酶液化法生產謝村黃酒的最佳液化及糖化工藝,隨后以酒精度與花青苷含量為指標,確定了醪液最優發酵工藝參數:即原料經焙炒處理后添加50 U·g-1高溫α-淀粉酶,在85 ℃下液化50 min,其后加入70 U·g-1糖化酶,在75 ℃下糖化150 min。料液比為1∶2.5,主酵溫度為30 ℃,酒曲添加量為0.25%。在此工藝條件下所得謝村黃酒的酒精度為(20 ℃)10.8%vol,總糖(以葡萄糖計)為6.4 g/L,總酸為5.03 g/L,pH為4.08,花青苷含量為284.17 mg/L。酒體呈紅棕色,具有黃酒的典型特征與黑糯特有香味,酒體協調,酒味醇厚。

目前,以黑糯米為釀造原料生產黃酒的相關研究已有不少報道。在原料處理時大多采用傳統“浸米-蒸飯”工序[13,28-30],致使黑米有效成分溶出,本研究以“焙炒”替代傳統“浸米-蒸飯”,避免了原料處理造成的浪費問題。但實驗中仍存在不足之處,焙炒處理后的米含有焦香,這對謝村黃酒香氣成分的影響仍有待進一步的研究;黑糯米中含有大量的生理活性物質,本研究僅以主酵過程中花青苷含量進行優化,花青苷在酒體陳釀過程中的變化以及其他生理活性物質在酒體中是否保留還需要進一步研究。