消解-GFAAS法檢測腫瘤患者用藥后血清中總鉑的方法研究

張浴玲，郭岱年，陳晨，方翎

(1.汕頭大學醫學院環境醫學與發育毒理學實驗室，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院靜脈用藥調配中心，廣東 汕頭 515041)

含鉑藥物作為重要的抗腫瘤藥物，廣泛應用于臨床各種腫瘤的治療[1]。鉑類藥物作為傳統的抗腫瘤藥物，其療效明顯，卻也被報道了不少不良反應，如過敏、瘙癢等免疫系統癥狀及惡心、嘔吐等胃腸道癥狀[2-3]，目前國內大部分研究聚焦于某一種鉑類藥物引起的不良反應，對用藥后某種鉑類藥物的血藥濃度進行檢測報道的占大多數，卻未曾探索所有鉑類藥物共有的不良反應，是否與鉑作為重金屬元素的蓄積相關。有報道指出，從呼吸道吸入的鉑，可能引起免疫球蛋白介導的Ⅰ型過敏反應[4]，國外有報道指出，即使是在結束化療5～10年后，患者體內鉑的蓄積仍然與神經毒性相關[5]。針對目前關于總鉑的測量與研究較少，且方法不一，大部分方法較煩瑣，需要復雜的消化過程[6]、使用基體改進劑[7-8]或使用運行成本較高的儀器等情況[9]，本研究旨在通過使用石墨爐原子吸收分光光度儀，探索適合血清中總鉑含量測定的前處理方法及儀器條件，為用藥后體內鉑總量測定提供經濟、便捷、有效的方法依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 儀器：GFAAS-650 石墨爐原子吸收分光光度儀(德國耶拿)；APE-60自動進樣器；移液器(0～1 000 μL、0～200 μL，德國艾本德)；鉑空心陰極燈(中國北京有色金屬及電子材料分析測試中心)。

試劑：硝酸(65%，優級純，美國默克)；Triton X-100(Solarbio Life Science)；鉑標準液(1 000 μg·mL-1,北京有色金屬及電子材料分析測試中心)；高純氬氣(汕頭市第一氣體廠)。

1.2 標準品及樣本配制 空白液：0.5%硝酸溶液。

標準儲備液：用空白液對鉑標準液進行稀釋至終濃度為100 μg·L-1的標準儲備液。

基體改進劑：用空白液對Triton X-100進行稀釋并調整自動進樣器的進樣量，使其最終濃度為0.25%。

樣品溶液配制：經醫師評估需使用順鉑或奧沙利鉑進行化療的患者，注射順鉑或奧沙利鉑后第4天(確保藥物在體內經過了至少1個半衰期)，抽取患者靜脈血1 mL，以3 500 rpm的轉速離心獲得血清約0.5 mL，分別吸取使用奧沙利鉑及順鉑患者的血清100 μL混合，以0.5% 硝酸溶液稀釋至1 mL，上機待測。

1.3 工作條件 工作條件設定：波長為265.9 nm，狹縫寬度為0.2 nm，燈電流8 mA，塞曼效應扣背景，2-磁場，最大強度0.9 T，進樣體積20 μL，峰面積定量，保護氣：氬氣99.999%；進樣深度-0.60 mm，標準儲備液濃度100 μg·L-1，測量次數為2次。

石墨爐溫度程序的設定：為了探索適合血清鉑檢測的工作條件，對石墨爐升溫程序進行了調試，分別嘗試了廠家推薦的條件-溫度程序1、調整的條件2-溫度程序2、調整的條件3-溫度程序3。

是否需要加基體改進劑的測定：在獲得適宜溫度程序之后，對樣本檢測是否需要加入基體改進劑進行對比。

2 結果

2.1 石墨爐溫度程序的檢測結果比較 通過廠家推薦的溫度程序(見表1)檢測樣品或標樣(濃度為25 ppb)都沒有明顯的吸收峰(見圖1～2)，將標樣濃度加大至100 ppb時，得圖3，峰型較差。說明在該溫度條件下，鉑的靈敏度不夠，不足以將鉑釋放并很好地轉化為基態原子，因此通過改進灰化和原子化溫度進行調節。

表1 溫度程序1

圖1 條件1檢測樣品吸收峰圖

圖2 條件1檢測標樣(25 ppb)吸收峰圖

圖3 條件1檢測標樣(100 ppb)吸收峰圖

嘗試條件2(見表2)，將原子化溫度升至2 600 ℃，全速率升溫，與圖3相比，可得吸收峰，但峰型(見圖4)不理想。

表2 溫度程序2

圖4 條件2檢測標樣吸收峰圖(100 ppb)

嘗試溫度程序3(見表3)，原子化溫度升至2 700 ℃，并以較緩慢的速率(700 ℃·s-1)上升，灰化溫度調整為1 150 ℃，可得樣品及加標的吸收峰，峰型理想(見圖5～6)，背景對待測元素峰型干擾不大，兩次樣品檢測RSD為0.53%，兩次樣品加標檢測的RSD為0.62%，在溫度程序3的基礎上，將原子化溫度升高至2 750 ℃，發現2 750 ℃時同一樣品吸光度為0.092 6(見圖7)，而2 700 ℃吸光度為0.092 70(見圖5)，認為2 700的原子化溫度更適合。以條件3擬合曲線(見圖8)，得擬合度0.990 1。

表3 溫度程序3

圖5 條件3檢測樣品吸收峰圖

圖6 條件3檢測樣品加標(35 ppb)吸收峰圖

圖7 條件3-原子化2 750 ℃的樣品吸收峰圖

圖8 條件3-標準曲線

在溫度程序3的條件下，采用加標回收率法檢測回收率，所得回收率均值為94.77%(見表4)。

表4 加標回收率結果

檢測限：對空白溶液進行11次檢測，獲得吸光度的均值為0.002 2，換算出濃度的檢測限為31.16 μg·L-1。

2.2 是否加基體改進劑的檢測結果比較 采用溫度程序3，加用基體改進劑(0.25% Triton-100 溶液)，測試樣本吸光度為 0.086 27，低于未加基體改進劑樣本的吸光度(0.092 70)(見圖9～10)。

圖9 加基改的樣品吸收峰圖

圖10 未加基改的樣品吸收峰圖

3 討論

3.1 總鉑的測定方法 順鉑、奧沙利鉑等鉑類藥物進入體內后，90%與血漿蛋白結合[10]，經過一系列代謝過程后，部分以游離狀態存在于血液中，一般高效液相色譜法或近年來開展的熒光探針法[11]，都只能檢測結合型鉑的含量，如順鉑或奧沙利鉑的血藥濃度，難以測定鉑元素含量。本研究采用石墨爐原子吸收法，前處理過程使用硝酸，具有強氧化性，可溶解大多數有機物和金屬，消化血液成分中的蛋白質等雜質，在高溫條件(灰化溫度大約在1 000 ℃左右)下，可以使有機物和大部分無機鹽氣化，減少共存物對待測元素的干擾，然后在超高溫度(原子化溫度達2 700 ℃)的條件下，使待測元素鉑原子化，再以特征波長的光照射，從而檢定光的吸收量(吸光度)而獲得樣本總鉑量。對比其他使用原子吸收檢測鉑的方法，大部分研究采用的是血漿樣本[10,12-14]，可能造成檢測結果偏于結合型鉑(即與血漿蛋白結合的原形藥)的水平，而非鉑元素含量。近年來越來越多的研究采用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)和電感耦合等離子體原子發射光譜(ICP-AES)檢測血清中的鉑元素,與AAS相比，ICP-AES/MS能同時高通量檢測多種元素，工作效率優于AAS，但ICP-AES/MS條件摸索較難，尤其是同一樣本溶液中各元素含量差異過大時，難以調試出適合不同金屬檢出限的方法。從儀器的靈敏度來看，ICP-MS的檢出限最優，大部分元素為ppt級；GFAAS次之，檢出限為亞ppb級；ICP-AES一般為1～10 ppb。從運營成本來看，ICP-AES/MS使用的成本遠高于GFAAS，僅高純氬氣而言，ICP-MS的氬氣使用量為20 L·min-1(分析狀態)，即每一瓶常規高純氬氣可以檢測75例樣本，而使用GFAAS則每瓶氬氣可檢測300例樣本。另外，ICP-AES/MS運行還需使用高純氦氣及氫氣，配件維護及更換的成本也遠高于GFAAS。因此，如果不是進行高通量或超痕量分析，從經濟成本和使用儀器的便捷性來看，選擇GFAAS更適合。本研究所使用的GFAAS，國內大部分醫療衛生或科研機構具備，研究獲得檢測血清中總鉑含量的方法，可為這些機構提供參考。

3.2 各個階段溫度對檢測結果的影響 石墨爐4個升溫程序及其主要作用如下：①干燥：蒸發除去樣本的溶劑，如水分或各種酸溶液；②灰化：破壞并除去樣本中的基體，盡量將共存組分和待測元素分開，減少共存物和背景吸收的干擾,灰化溫度一般在1 000 ℃左右，可以除去大部分的有機物；③原子化：將待測元素轉化為基態原子，供吸收測定；④除殘：凈化除去殘渣，消除石墨管記憶效應。

每個階段的溫度和持續時間都可能對檢測結果產生影響，本研究首先采用儀器推薦的條件，發現出峰不明顯，將標準品濃度提高至100 ppb時，才稍有出峰，但峰型結果顯示，出峰不完整，系原子化溫度太低，鉑原子原子化不足所致，因此調整原子化至2 600 ℃，獲得較好的出峰情況，但峰型呈鋸齒狀，提示原子化仍然不足。再將灰化溫度提高至1 150 ℃，原子化溫度提高至2 700 ℃，速率設為700 ℃·min-1，獲得明顯改善的峰型。原子化溫度是檢測樣本的關鍵，直接關系到目標元素是否充分原子化，但過高的原子化溫度會過度損耗石墨管和石墨爐腔體，因此要在能獲得目標元素最高檢測結果的情況下選擇最低的原子化溫度,本研究采用了獲得最高吸光度值及平滑完整峰型的溫度條件(原子化溫度2 700 ℃)。選擇了該溫度條件后，通過加標回收率評估了該條件的適用性，并通過檢出限試驗，獲得31.16 μg·L-1的鉑檢出限值，靈敏度高于其他研究[15]。因此，本研究溫度條件適合該儀器進行血清總鉑的測量。

3.3 基改的優點與缺點 本研究所試用基體改進劑為Triton X-100，是一種非離子表面活性劑，用于消除基質干擾,然而有研究指出,Triton X-100對石墨管損傷較大，目前的報道對是否需使用基體改進劑說法不一[16]，本研究通過對比是否加入Triton X-100的兩種檢測結果，發現加入Triton X-100的樣本吸收峰值與干擾背景峰值同時降低，而未加入Triton X-100的樣本能夠獲得最大吸收值，檢測回收率及偏差也在允許范圍內。因此本研究認為，血清中的鉑含量測定，前處理過程無須加入基體改進劑。

綜上，本研究中血清前處理方法及石墨爐檢測溫度程序適用于GFAAS-650對總鉑的濃度測定，且本方法簡單易行，靈敏度高，相對標準偏差及經濟成本較低，適合國內使用石墨爐原子吸收分光光度儀檢測腫瘤患者總鉑含量的機構。