DNA條形碼技術在陜西省鼠形動物鑒定中的應用

陳寶寶，孫養信，范鎖平，呂 文，聶守民，李勝振，安翠紅

鼠形動物主要包括嚙齒目、兔形目和食蟲目[1], 外型類似鼠類，是鼠疫、流行性出血熱、鉤端螺旋體病等多種自然疫源性疾病的儲存宿主和傳播者，可通過體外寄生蟲叮咬、排泄物污染或直接咬人傳播疾病，嚴重危害人類健康，造成巨大經濟損失。了解疫源地鼠形動物的種類和數量對于鼠傳疾病的防治有重要作用，而快速準確地識別宿主動物是傳染病現場防控工作的首要任務。DNA 條形碼技術開創了物種鑒定新時代，目前已在多種動物中得到證實，其不僅在鑒別物種方面快速準確, 而且在幼殘體鑒定、區分近緣種、發現隱存種等方面具備絕對優勢[2-6]。陜西省地處我國西北地區東部,南有秦巴山地，北有黃土高原，其間夾有渭河關中平原，按照地理環境可以分為陜北、關中、陜南3部分。陜北地區地貌為黃土高原丘陵溝壑區和沙漠生境，關中地區屬渭河平原地帶，陜南屬秦巴山地生境[7-8]。由于自然環境復雜，景觀多樣，有多種鼠形動物，2012—2018年，結合鼠疫監測工作，對陜西省鼠形動物的分布、種群組成進行了調查, 同時，基于線粒體 COI 基因進行分析，積累我省鼠形動物DNA條形碼數據，探索利用 DNA 條形碼鑒別鼠形動物的可行性。

1 材料與方法

1.1標本采集 2012—2018年，結合鼠疫監測工作，選擇全省22個縣(區)作為調查點，使用樣方法、5 m夾籠法、夾夜法采集鼠形動物標本，不同地區方法不同，所有標本形態學初步鑒定后無菌采集少許肝臟保存于無水乙醇中備用。

1.2DNA的提取 根據QIAGEN DNAeasy試劑盒提取步驟制備所有收集鼠形動物的DNA模板。

1.3COI基因的擴增 首先選用通用引物BatL5310/ R6036R擴增COI基因，當通用引物擴增反應失敗時, 則選用雞尾酒引物，引物序列、PCR反應體系及條件參照參考文獻[6]。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，若電泳圖中出現目標條帶即送樣測序。引物序列合成及測序均由西安某生物公司完成。

1.4COI基因序列分析 測序結果首先觀察峰圖質量, 如較差則重新擴增和測序。將測定序列在美國國立生物技術信息中心(NCBI)網站上運行BLAST核酸序列同源性檢索。運用Mega 6軟件比對各基因序列的堿基組成和變異,基于Kimura-2-parameter(K2P) 模型計算各物種的遺傳距離；采用Neighbor-Joining(NJ)鄰接法構建系統樹[9]。

2 結 果

2.1COI基因的獲得 在全省陜北、關中、陜南地區的22個縣(區)調查點總計獲得709只鼠形動物的COI基因序列，隸屬于3目10科24屬38種，種屬分類標準參照王應祥[10](2003)《哺乳動物分類名錄》。序列經NCBI同源性檢索，除顯孔攀鼠、甘肅倉鼠、豬尾鼠及麝鼴4種鼠形動物未找到相應序列以外，其余均與NCBI中相應序列的同源性在97%以上(表1)。

2.2形態學鑒定結果的糾正 基于外部形態特征的初步鑒定, 經COI基因序列分析發現，有部分標本鑒定有誤，例如秦巴山區部分標本形態學鑒定為大林姬鼠, 但與高山姬鼠的相似度在97%以上，確定為高山姬鼠；南鄭、寧陜部分黃胸鼠與褐家鼠的鑒定混淆；鎮坪捕獲的3只鼩鼱，形態學無法鑒定種，分子鑒定發現，其中1只COI基因序列與另外2只的遺傳距離在22%左右，經NCBI比對，與黑齒鼩鼱的相似度為97%，確定為黑齒鼩鼱，另外2只與鼩鼴屬的相似度為93%，確定為鼩鼴屬，但因NCBI缺少相關數據，還有待進一步確定到種。采集的黃鼠最初判定為達烏爾黃鼠，經NCBI比對均為阿拉善黃鼠，鼠兔形態學鑒定認為是達烏爾鼠兔，分子鑒定與青海間顱鼠兔相似度更高。

2.3COI基因序列分析 對獲得的709條COI基因序列在不同科、屬、種范圍內進行序列分析，結果顯示嚙齒目5科之間的遺傳距離為18.2%～30.4%，其中鼠科7個屬之間的遺傳距離為14.4%～21.5%，姬鼠屬種間遺傳距離為6.5%～16.4%，中華姬鼠與其他兩種姬鼠的遺傳距離較大，在14.7%～16.4%之間；倉鼠科屬間遺傳距離為14.8%～22.5%，倉鼠屬種間遺傳距離在7.2%～14.4%之間。食蟲目、兔形目科間遺傳距離分別為23.3%～27.2%、23.4%～24.2%之間。所有樣本的種內遺傳距離均在3.6%以內, 平均為1.4%，種間遺傳距離大于5.6%, 屬間、科間遺傳距離界限不明顯(圖1)。

圖1 陜西省鼠形動物COI基因序列遺傳距離差異分析Fig.1 Analysis of genetic distance on COI gene sequence of Shaanxi Province

表1 鼠形動物種類、來源及COI基因序列同源性比對結果
Tab.1 Species, sources and homology comparison results of COI gene of samples

目科屬種來源數量參考序列相似度(%)嚙齒目Rodentia鼠科Muridae家鼠屬Rattus黃胸鼠R. tanezumi石泉、南鄭、寧強、佛坪、周至、寧陜48KF011916.1≥99褐家鼠R.norvegicus石泉、南鄭、定邊、寧陜、神木、鎮坪38KM820832.1≥99大足鼠R.nitidus南鄭、寧強、佛坪、山陽、寧陜、鎮坪21NC_040919.1≥98白腹鼠屬Niviventer針毛鼠N.fulvescens寧強、寧陜、山陽、鎮巴13KP455488.1≥99社鼠N.confucianus眉縣、南鄭、寧強、太白、柞水、佛坪、鳳縣、山陽、寧陜、周至、鎮坪、鎮巴71KJ152220.1≥99安氏白腹鼠N. andersoni鎮巴1KU531772.1≥99長尾巨鼠屬Leopol-damys白腹巨鼠L.edwardsi南鄭1KP995204.1≥99攀鼠屬Vernaya顯孔攀鼠V. foramena鎮巴1 ─ ─小鼠屬Mus小家鼠M.musculus石泉、府谷、定邊、寧陜、榆陽16LC228857.1≥99巢鼠屬Micromys巢鼠M.minutus寧陜1KP399599.1≥99姬鼠屬Apodemus中華姬鼠A.draco眉縣、南鄭、太白、柞水、佛坪、寧陜、山陽、周至、鎮坪49HQ333255.1≥99黑線姬鼠A.agrarius眉縣、南鄭、寧強、太白、鳳縣、黃龍、寧陜、鎮巴34KY851957.1≥99高山姬鼠A.chevrieri南鄭、太白、柞水、佛坪、鳳縣、山陽、周至、寧陜、鎮巴96KF999112.1≥97倉鼠科Circetidae倉鼠屬Cricetulus黑線倉鼠C.Barabensis大荔、鳳縣5KX882054.1≥97中國倉鼠C. griseus定邊(形態學鑒定為黑線倉鼠)2EF568628.1100索氏倉鼠C.sokolovi靖邊、定邊(形態學鑒定為黑線倉鼠)70KJ466858.1≥98長尾倉鼠C.longicau-datus榆陽、府谷7KM067270.1≥97大倉鼠C.tritonde大荔、榆陽5EU031048.1≥98甘肅倉鼠屬Cansumys甘肅倉鼠C.canus寧陜、山陽4─ ─毛足鼠屬Phodopus小毛足鼠P.Rborovskii定邊、榆陽、靖邊19KU885975.1≥99絨鼠屬Eothenomys黑腹絨鼠E.melano-gaster鎮坪3KP997311.198絨屬Caryomys洮州絨鼠C. eva眉縣2HM165358.197苛嵐絨鼠C.inez寧陜、鳳縣、佛坪、山陽6KU200225.199田鼠屬Microtus棕色田鼠M. mandari-nus大荔4JX014233.198東方田鼠M. fortis定邊2JF261174.199

表1(續)

表1(續)目科屬種來源數量參考序列相似度(%)沙鼠屬Meriones子午沙鼠M.meridia-nus定邊、大荔、府谷、榆陽29KR013227.1≥99長爪沙鼠M. unguicu-latus定邊43KF425526.1≥99刺山鼠科Platacanthomyi-dae豬尾鼠屬Typhlomys豬尾鼠T.cinereus鎮巴1─ ─跳鼠科Dipodidae五趾跳鼠屬Allactaga五趾跳鼠A.sibirica定邊2KC193065.198三趾跳鼠屬Dipus三趾跳鼠D.sagitta府谷、靖邊、定邊、榆陽27KX399540.199松鼠科Sciuridae黃鼠屬Spermophilus阿拉善黃鼠S.alas-chanicus定邊、吳起、靖邊、大荔、府谷39KM537979.199兔形目Lagomorpha鼠兔科Ochotonidae鼠兔屬Ochotona間顱鼠兔O. cansus定邊、吳起(形態學鑒定為達烏爾鼠兔)12KT805364.199兔科Leporidae兔屬Lepus草兔L. capensis定邊2GU937113.199食蟲目Insectivora 鼩鼱科Sorici-dae微尾鼩屬Anourosorex四川短尾鼩A. squa-mipes鎮坪、鎮巴、太白、南鄭30KJ545899.199短尾鼩鼱屬Blarinella 黑齒鼩鼱B.quadrati-cauda鎮坪1KJ131179.197鼴科Talpidae麝鼴屬Scaptochirus麝鼴S. moschatus定邊1─ ─鼩鼴屬Uropsilus鼩鼴U. soricipes鎮巴1KP245954.197待定種Uropsilus. sp鎮坪(形態學鑒定為鼩鼱)2KP245954.193合計709

注：“─”表示NCBI GenBank中未找到相應序列。

2.4系統樹構建及可能存在的隱種 從圖2可以看出，所有樣本分成40個高支持度的單一分支，高山姬鼠、黑線倉鼠分支內出現了高支持率的小支系, 高山姬鼠小分支內個體間遺傳距離為0%～1.1%, 而分支間個體之間的遺傳距離在2.8%～3.6%之間，遺傳距離數值處于種內遺傳距離與種間遺傳距離的邊緣。黑線倉鼠小分支內個體間遺傳距離在1.7%以內, 分支間遺傳距離差異較大，在7.3%～10.2%之間，通過與國內其他地區的倉鼠比較分析顯示，大荔、鳳縣境內采集的為黑線倉鼠(C.Barabensis)，定邊縣境內采集的有2種，分別為索氏倉鼠(C.sokolovi)和中國倉鼠(C.griseus)，其他地區采集的均為索氏倉鼠。

3 討 論

陜西省自然環境復雜，鼠形動物物種豐富，王廷正等[7]記載的陜西省嚙齒動物嚙齒目、兔形目總計11科55種，其中嚙齒目52種，兔形目3種。王應祥[10]在《中國哺乳動物物種和亞種分類名錄與分布大全》中記載的陜西分布的食蟲目有16種，兔形目有3種。對鼠形動物準確分類和科學防治是預防和控制多種傳染病的基礎。動物線粒體 DNA結構簡單、呈母系遺傳且進化速度快，是研究種間分子進化和系統發育最佳選擇。基于線粒體COI基因的 DNA 條形碼分子分類方法克服了傳統形態學分類存在的缺陷，成為生物分類學研究中的研究熱點。

我省從2011年開始將DNA條形碼技術應用到鼠種鑒定中，2012年應用該技術首次在定邊縣鼠疫疫區鑒定出東方田鼠[11]，2014年對7個鼠種8個不同部位的62份殘體標本擴增的COI基因比對結果與形態學鑒定相吻合[12-13]；2015年通過與寧夏、內蒙黃鼠COI基因序列比對發現，我省黃鼠與寧夏阿拉善黃鼠的遺傳距離≤0.5%,與內蒙達烏爾黃鼠遺傳距離在7.9%～9.3%之間, 從而將我省多地分布的達烏爾黃鼠更名為阿拉善黃鼠[14-16]。

圖2 基于COI基因部分樣本的NJ系統發育樹Fig.2 A neighbor-joining phylogenetic tree of partial samples based on COI gene

Hebert等[17]對動物界13 320個物種的COI基因序列比較分析發現，98%的物種種內差異在0%～2%；平均種間差異為11.3%。馬英等[6]對青海省110只小型獸類COI基因序列分析顯示,種內遺傳距離≤3%, 種間遺傳距在5%～10%之間, 屬間為12%～19%。本研究對陜西省境內捕獲的709份鼠形動物COI基因進行擴增分析，在不同科、屬、種范圍內分析其遺傳距離差異，結果顯示所有樣本的種內遺傳距離均在3.6%以內, 平均為1.4%，種間遺傳距離大于5.6%, 與上述研究結果基本吻合；屬間、科間遺傳距離界限不明顯，但種間遺傳距離顯著大于種內遺傳距離，而種內和種間遺傳距離的大小是進行物種間鑒定的重要標志，較大的種間差異是對物種進行準確鑒定的先決條件[18]，說明基于COI 基因序列的 DNA 條形碼技術能夠對多種鼠形動物進行有效的物種鑒定。

DNA條形碼技術在區分近緣種、發現隱存種等方面有一定的優勢。從系統發育樹可以看出，所有樣本分成40個高支持度的單一分支，高山姬鼠、黑線倉鼠分支內出現了高支持率的小支系, 經個體間遺傳距離分析，高山姬鼠分支之間數值(2.8%～3.6%)處于種內遺傳距離與種間遺傳距離的邊緣，由于樣本采自不同的監測點，是否是因生境的差異性造成的遺傳距離較大，還是屬于2個種，有待進一步確認。而黑線倉鼠分支間遺傳距離差異較大，進一步分析顯示，屬于不同的種，分別為黑線倉鼠、索氏倉鼠和中國倉鼠。同時，通過序列的同源性比較，分析發現，我省的鼠兔為間顱鼠兔而非達烏爾鼠兔， 后續將通過模式標本的形態學數據加以印證。

當然，DNA條形碼技術還存在一些不足之處，DNA條形碼數據庫還在進一步的完善中，不是所有的鼠形動物都能找到完全相匹配的數據，而且，不同類群內物種間由于環境等因素的影響，遺傳距離可能不同, 而現有DNA條形碼數據積累的物種判斷閾值可能對物種多樣性造成一定的誤判。傳統分類學是生物多樣性研究和保護的基礎，因此，應將傳統的分類學鑒定方法和現代分子生物學鑒定方法結合，以保證結果的準確可靠性。

利益沖突：無