海南省西部地區萊姆病血清學調查

朱 雄，侯學霞，于 莉，張 琳，陳運優，苗廣青，陳 婷，郝 琴，何呂芬

萊姆病(Lyme disease)是由伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi, BB) 感染引起的，一種由媒介蜱傳播的自然疫源性人獸共患病。1982年，Burgdorferi W等[1]首次從肩突硬蜱體內成功分離出螺旋體，螺旋體感染通常是開始于肩突硬蜱幼蟲階段，主要以哺乳動物為宿主，積聚于宿主中腸。病原體進入機體后早期表現為皮膚游走性紅斑、流感樣癥狀、關節痛、肌肉痛、胸痛等癥狀，晚期可表現為面神經炎、腦膜炎、面神經麻痹、肢體麻木等神經系統受損[2-3]。萊姆病在美國稱為第二“艾滋病”,被列為世界性公共衛生問題[4]。目前，萊姆病在亞洲、歐洲、美洲、大洋洲、非洲等 70多個國家均有報道，分布廣泛[5]。萊姆病在我國30個省、市、自治區都有過相關報道，主要集中在東北林區，南方許多省份也有報道[6]。有學者已證實海南三亞存在萊姆病病原體感染[7-8]。然而萊姆病在海南西部地區的分布情況不明確，因此，本文通過對海南西部地區的關節炎或神經癥狀病患者開展萊姆病血清流行病學調查研究，了解海南省西部地區萊姆病感染狀況。

1 材料與方法

1.1血清樣本的收集 2015年08月30日至11月30 日，從東方市人民醫院收集400份血清，儋州市人民醫院收集500份血清。所有血清均來源于患有關節炎癥狀或神經系統癥狀患者，均排除風濕性關節炎等其他疾病。

1.2主要試劑 羊抗人IgM和IgG熒光抗體、HRP標記的羊抗人IgM 和SPA，均購自美國Sigma公司。萊姆病抗原片和WB膜條由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所萊姆病室提供。

1.3 萊姆病抗體檢測

1.3.1間接免疫熒光實驗(IFA) 將血清用3%卵黃液從1∶16開始倍比稀釋，在熒光顯微鏡40×10視野下,50%以上螺旋體染上明亮熒光，抗體效價IgM≥1∶64,IgG≥1∶128為陽性。同時做陽性、陰性對照。

1.3.2蛋白免疫印跡法(WB) 將IFA初篩的陽性標本用WB進一步檢測。用PBS-T以1∶25稀釋血清并浸泡抗原條，震蕩4 h，洗脫3～5次，每次5～10 min，將抗原條分別加入二抗IgG或IgM，過夜。再經過洗脫5次，每次5～10 min，加入顯色劑顯色30 min。顯色結束，用純水終止反應。WB結果根據中國萊姆病WB診斷標準進行判定[9-10]，當OspA、OspB、OspC、14 kD、17 kD、28 kD、30 kD、39 kD、58 kD、66 kD、83/100 kD中至少有一條蛋白顯色即可診斷IgG陽性；OspA、OspB、OspC、14 kD、17 kD、30 kD、39 kD、58 kD、83/100 kD中至少有一條蛋白帶顯色可診斷IgM陽性；如果是41 kD顯色，須進一步作梅毒螺旋體和鉤體鑒別診斷。

1.4統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計數資料以率表示， 采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1萊姆病血清學抗體檢測結果 利用IFA方法檢測血清樣本900份，35份陽性，其中IgG陽性 28份，IgM 陽性共10份，有3份樣本的IgG和IgM同時為陽性。這次調查結果顯示，海南省西部地區關節炎或神經性疾病患者的萊姆病的IFA陽性率為3.89%(見表1)。對IFA 檢測陽性的35份血清樣本進一步用 WB方法確認，結果顯示共有15份 WB檢測陽性， 其中IgG陽性10份， IgM 陽性8份，有3份樣本的IgG和IgM同時為陽性(見表2)。

2.2不同性別人群感染狀況 所有調查對象中, IFA方法檢測男性血清萊姆病總抗體陽性率4.33%，高于女性的3.52%(見表3)，但差異無統計學意義(χ2=0.389，P=0.533)。經IFA和WB兩步法檢測男性血清萊姆病總抗體陽性率1.68%，女性血清萊姆病總抗體陽性率1.66%(見表3)，差異無統計學意義(χ2=0.001，P=0.975)。

2.3不同年齡人群萊姆病感染情況 所有調查對象中,所有年齡組均檢出陽性者， 血清萊姆病抗體陽性標本的患者年齡跨度為5～85歲。其中，IFA方法檢測結果，≤20歲為4人,陽性率最高，為11.76%(4/34),21～40歲次之，陽性率為8.60%(8/93)，41～60歲、61～80歲和≥81歲陽性率分別為1.85%(5/271)、4.21%(15/356)、2.40%(3/125)，另有21份樣本無年齡報告(見表4)。以上人群的感染率，差異有統計學意義(χ2=14.684，P=0.005)。IFA和WB兩種方法檢測結果，≤20歲、21～40歲、41～60歲、61～80歲和≥81歲陽性率分別為11.76%(4/34)、3.23%(3/93)、0.74%(2/271)、1.40%(5/356)和0.80%(1/125)，不同年齡人群萊姆病感染率差異有統計學意義(χ2=24.108，P<0.001)。見圖1。

表1 海南西部地區萊姆病血清學抗體檢測結果
Tab.1 Serological antibody detection of Lyme disease in Western areas of Hainan Province

抗體類型檢測數IFA法陽性數陽性率(%)IgG900283.11IgM900101.11IgG和IgM90030.33IgG和(或)IgM900353.89

表2 35例IFA陽性標本的 WB檢測結果
Tab.2 Results of WB detection in 35 IFA positive samples

序號性別年齡首診癥狀IgG(+)IgM(+)1女5神經癥狀33 kD37,39 kD2男8神經癥狀37,39 kD-3男12神經癥狀37,39 kD-4男13神經癥狀-39 kD5女59神經癥狀37,39 kD-6女28神經癥狀-33 kD7女30關節癥狀39 kD-8男33關節癥狀39 kD39 kD9男63神經癥狀37,39 kD-10男63關節癥狀39 kD-11女68關節癥狀-66 kD12男68關節癥狀31 kD31 kD、28 kD13女57關節癥狀-83-100 kD14女73關節癥狀39 kD-15女85關節癥狀-36 kD

表3 不同性別人群血清萊姆病抗體檢測結果
Tab.3 Results of serum antibody of Lyme disease in different sex groups

性別檢測數IFA法WB法陽性數陽性率(%)陽性數陽性率(%)男416184.3371.68 女483173.5281.66 不詳100.0000.00

2.4不同癥狀患者萊姆病感染情況 對不同癥狀人群萊姆病血清抗體檢測結果顯示, IFA方法檢測關節癥狀患者萊姆病總抗體陽性率4.47%，略高于神經癥狀的陽性率3.19%(見表5)，但差異無統計學意義(χ2=0.986，P=0.321)。IFA和WB兩種方法檢測關節癥狀患者萊姆病總抗體陽性率1.63%，略低于神經癥狀的陽性率1.72%(見表5)，但差異無統計學意義(χ2=0.011，P=0.917)。

表4 不同年齡人群血清萊姆病抗體檢測結果
Tab.4 Results of serum antibody of Lyme disease in different age groups

年齡組檢測數IFA法WB法陽性數陽性率(%)陽性數陽性率(%)≤2034411.76 411.76 21～409388.60 33.23 41～6027151.85 20.74 61～80356154.21 51.40 ≥8112532.40 10.80 不詳2100.00 00.00

圖1 不同年齡人群血清萊姆病抗體陽性率Fig.1 Positive rate of serum antibody of Lyme disease in different age groups

表5 不同癥狀患者血清萊姆病IFA檢測結果
Tab.5 Results of IFA test in Lyme patients with different symptoms

癥狀檢測數IFA法WB法陽性數陽性率(%)陽性數陽性率(%)關節癥狀492224.47 81.63 神經癥狀408133.19 71.72

3 討 論

萊姆病分布廣泛，發病率呈上升趨勢，新的疫源地不斷發現。在北美洲，萊姆病的疫源地主要分布于東北部、中西部及西部地區。在歐洲，病例主要分布在北歐和中歐地區[5,11]。在亞洲，分布在日本和中國。我國萊姆病的疫區主要集中在東北部、西北部和華北部分地區的林區，分布范圍比較廣，新疆、黑龍江、吉林等省(自治區) 已有大量萊姆病發病的病例報告，而且大多數地區已經分離出病原體[6,12]。海南省位于中國的最南端，它的自然地理條件與我國萊姆病發生率高的地區差異極大。2011年金玉明等[13]報道了蜱感染疾病。2015—2018年，朱雄等[7-8]對海南省三亞市關節炎和神經癥狀患者進行血清萊姆病伯氏疏螺旋體抗體篩查，確證海南省存在萊姆病。

本次研究從海南西部地區萊姆病疑似患者血清中檢出萊姆病抗體，表明海南省西部地區人群存在萊姆病感染。在關節炎和神經性疾病患者中，IFA法初篩陽性率為3.89%，并通過WB方法確診萊姆病15例，感染率1.67%，人群總感染率低于2018年三亞地區調查結果[8]。表明在海南省西部地區存在關節炎和神經系統癥狀的萊姆病患者，提示當地的臨床醫生對該類患者應考慮是否患萊姆病。

本研究結果表明，900例血清樣本中，IFA法檢測初篩陽性率為3.89%，而WB法檢測陽率為1.67%，IFA法陽性率高于WB法，原因是IFA法與鉤端螺旋體、梅毒螺旋體等有交叉反應導致假陽性結果。2010年，Biesiada G[14]研究表明檢測萊姆病需要用兩步診斷方法(Two-step diagnosis)，即ELISA 或 IFA 法初篩為陽性，且 WB法檢測結果為陽性即可確診，以此來提高診斷的特異性和準確性。但血清學方法檢測萊姆病仍存在一些問題?？笲．burgdorferi的IgM 和IgG可長期存在于愈后病人或動物的血液中，無法辨別近期感染和繼發感染，所以血清學方法不能作為該病臨床療效的判定標準。

從取樣的性別和癥狀結果分析，不同性別和癥狀人群均有萊姆病螺旋體感染的發生，但差異無統計學意義。不同性別萊姆病螺旋體感染結果分析與武軍元等[15]研究結果一致，而李志清等[16]研究表明陜西省男性萊姆病總感染水平高于女性，王化勇等[17]研究表明北京市密云地區女性萊姆病總感染水平高于男性。

從不同年齡人群萊姆病血清抗體檢測結果看, 本次標本IFA和WB法檢測≤20歲年齡組的萊姆病感染率居首位, 陽性率為11.76% (4/34),這4例陽性患者均有神經癥狀；21～40歲年齡組次之，61～80歲年齡組居第3位。陜西省61～70歲年齡組人群萊姆病血清抗體陽性率最高[16]。新疆喀什市20～50 歲人群的感染率明顯高于 20歲以下和 50歲上人群的感染率[15]。萊姆病是通過蜱叮咬而感染的一種自然疫源性疾病，不同地區不同年齡組人群自然感染率的高低與蜱暴露的頻率及持續時間長短密切相關。

本研究認為海南西部地區存在萊姆病。本研究樣品數量有限，雖不能準確反映當地人群萊姆病流行的狀況，但是，為海南省萊姆病的防控提供了理論依據。提示當地醫務人員在進行臨床疾病的診斷中,對神經癥狀和關節癥狀的患者，應注意萊姆病的鑒別診斷,做到早發現、早診斷和早治療,控制并發癥的出現。同時,應重視林區工人、護林人員、農民以及青少年兒童的萊姆病知識的普及工作,提高當地人群的防護意識,減少蜱暴露及受蜱的叮咬概率,預防和控制萊姆病的發生與流行。

利益沖突：無