山東濟(jì)寧騷擾庫(kù)蚊對(duì)常用殺蟲(chóng)劑的抗性研究

王 洋，楊琳琳，楊秋蘭，劉宏美，宋 曉，程 鵬，王海防，王海洋，王懷位，劉麗娟，郭秀霞，張崇星，趙玉強(qiáng)，公茂慶

騷擾庫(kù)蚊(Culexpipiensmolestus)屬于庫(kù)蚊屬(GenusCulex)、庫(kù)蚊亞屬(SubgenusCulex)、尖音庫(kù)蚊復(fù)合組(Cx.pipiensComplex)，在我國(guó)此復(fù)合組還包括尖音庫(kù)蚊指名亞種(Cx.pipienspipiensLinnaeus，1758)、致倦庫(kù)蚊(Cx.pipiensquinquefasciatusSay，1823)、淡色庫(kù)蚊(Cx.pipienspallensCoquillett，1898)。騷擾庫(kù)蚊屬于自育性蚊蟲(chóng)，即雌蚊在不吸血的情況下也能進(jìn)行卵黃生成的過(guò)程，并可成功產(chǎn)卵。蚊蟲(chóng)的自育現(xiàn)象首先在尖音庫(kù)蚊[1](Cx.pipiens)中被發(fā)現(xiàn)，此后相繼證明騷擾庫(kù)蚊[2]、白紋伊蚊[3](Aedes.albopictus)、三帶喙庫(kù)蚊[4](Cx.tritaeniorhynchus)等也存在自育現(xiàn)象。騷擾庫(kù)蚊主要分布于西歐、中歐、北非、蘇丹、澳大利亞及北美等地[5]。在我國(guó)，北京、遼寧、內(nèi)蒙古、上海、湖北[6-7]等地均有記錄。本文在進(jìn)行濟(jì)寧地區(qū)淡色庫(kù)蚊抗藥性調(diào)查時(shí)，將采集的幼蟲(chóng)帶回實(shí)驗(yàn)室培育，發(fā)現(xiàn)蚊蟲(chóng)具有自育性，經(jīng)初步形態(tài)學(xué)鑒定確定為騷擾庫(kù)蚊。因此，我們進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定確定濟(jì)寧地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)騷擾庫(kù)蚊，并對(duì)其進(jìn)行多種殺蟲(chóng)劑抗性水平的研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1野外種群 2018年6月從濟(jì)寧市某小區(qū)半地下車(chē)庫(kù)積水中采集庫(kù)蚊幼蟲(chóng)，帶回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)至羽化，成蚊僅給予5%糖水喂食，不喂食血液而自育性產(chǎn)卵傳代飼養(yǎng)。敏感品系：騷擾庫(kù)蚊研究較少，無(wú)敏感品系存在，因此，我們選用山東省寄生蟲(chóng)病防治研究所常規(guī)飼養(yǎng)的淡色庫(kù)蚊敏感品系作為參考。飼養(yǎng)條件：溫度(25±1)℃、光周期：14 L∶10 D、相對(duì)濕度(70±10)%。

1.1.2主要儀器與試劑 儀器：SpectraMaxQuickDropTM超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Molecular Devices)；DYY-8C型電泳儀(北京六一儀器廠(chǎng))；Bio-Rad ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)。試劑：DNeasyBlood & Tissue Kit(德國(guó)Qiagen)；PrimeSTARHS DNA Polymerase(大連TaKaRa)；E.Z.N.A.MicroElute Gel Extraction Kit(美國(guó)Omega Bio-tek)。殺蟲(chóng)劑：DDVP(93%，油劑)、殘殺威(96%，粉劑)、氯氰菊酯(95%，油劑)、溴氰菊酯(98%，粉劑)為上海保康化工有限公司生產(chǎn)；蘇云金桿菌以色列亞種(Bacillusthuringiensisisraelensis，Bti)(600 IU/mg，顆粒劑)，由山東魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1形態(tài)學(xué)鑒定 隨機(jī)挑選一定數(shù)量的騷擾庫(kù)蚊雄蚊尾器制作成標(biāo)本進(jìn)行鑒定[6]。將標(biāo)本置于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，根據(jù)尾器中陽(yáng)莖內(nèi)葉、中葉的相對(duì)位置和形態(tài)特征進(jìn)行種類(lèi)比對(duì)和鑒定。

1.2.2PCR實(shí)驗(yàn) 采用DNeasyBlood & Tissue Kit進(jìn)行蚊蟲(chóng)DNA提取，SpectraMaxQuickDropTM超微量分光光度計(jì)測(cè)量提取樣品的DNA濃度。參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)特異性引物F(5′-GATCCTAGCAAGCGAGAAC-3′)和R(5′-CCCTCCAGTAAGGTATCAAC-3′)PCR擴(kuò)增騷擾庫(kù)蚊CQ11基因片段，所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)體系(50 μL)：5× PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 31.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃退火15 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，凝膠成像儀讀取結(jié)果。用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收與純化目的基因片段，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行blast比對(duì)分析。

1.2.3騷擾庫(kù)蚊抗性測(cè)定 幼蟲(chóng)浸漬法[9]，分別測(cè)試騷擾庫(kù)蚊現(xiàn)場(chǎng)種群以及淡色庫(kù)蚊敏感品系對(duì)DDVP、殘殺威、氯氰菊酯、溴氰菊酯、Bti 5種殺蟲(chóng)劑的敏感性。隨機(jī)選取孵化飼養(yǎng)至III齡末IV齡初的幼蟲(chóng)為測(cè)試對(duì)象，將待測(cè)的5種殺蟲(chóng)劑原液首先配制成母液，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定藥液的系列濃度范圍，進(jìn)而稀釋成5個(gè)不同的系列濃度。實(shí)驗(yàn)組：將25只幼蟲(chóng)放入盛有100 mL不同系列濃度藥液的白瓷碗中，每種藥液各濃度重復(fù)3次。以丙酮作為對(duì)照組，觀(guān)察并記錄現(xiàn)場(chǎng)種群以及敏感品系幼蟲(chóng)接觸藥液24 h后的死亡數(shù)(用玻璃棒輕輕觸動(dòng)幼蟲(chóng)，以之無(wú)移動(dòng)或呈痙攣狀態(tài)視為死亡)。根據(jù)每一濃度對(duì)應(yīng)的蚊蟲(chóng)死亡率，將藥液劑量取對(duì)數(shù)、蚊蟲(chóng)死亡率轉(zhuǎn)換為概率單位進(jìn)行回歸分析，求出半數(shù)致死濃度(LC50)值。若對(duì)照組死亡率大于20%，則該實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)作廢。

1.2.4數(shù)據(jù)處理 測(cè)定結(jié)果用SPSS19.0軟件計(jì)算每種藥液LC50值、毒力回歸方程、95%置信區(qū)間(95%CI)及抗性倍數(shù)(RR)。

1.2.5結(jié)果判定 RR=野外種群LC50/敏感品系LC50，RR≥20，為高度抗性；10≤RR<20，為中度抗性；2≤RR<10，為低度抗性；RR<2，為敏感。

2 結(jié) 果

2.1形態(tài)鑒別 騷擾庫(kù)蚊雄蚊尾器陽(yáng)莖側(cè)板腹內(nèi)葉外伸部分細(xì)短而呈鉤狀，背中葉末端平齊，而本地區(qū)常見(jiàn)的淡色庫(kù)蚊雄蚊尾器陽(yáng)莖側(cè)板腹內(nèi)葉外伸部分寬而呈葉狀，背中葉末端平齊或圓鈍[10-11](見(jiàn)圖1)。

圖1 騷擾庫(kù)蚊與淡色庫(kù)蚊尾器特征(圖片來(lái)源文獻(xiàn)[11])Fig.1 Morphological character of the genital is between Culex pipiens molestus and Culex. pipiens pallens

2.2擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定及核苷酸序列分析 經(jīng)1%的瓊脂糖電泳得到約250 bp左右的目的片段，與理論大小相符(圖2)。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行blast比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中騷擾庫(kù)蚊CQ11基因相似性為96%(圖3)。

2.2騷擾庫(kù)蚊抗性測(cè)定 濟(jì)寧市騷擾庫(kù)蚊幼蟲(chóng)對(duì)5種常用殺蟲(chóng)劑LC50分別為DDVP 11.311 7 mg/L、殘殺威5.859 9 mg/L、氯氰菊酯0.022 7 mg/L、溴氰菊酯0.014 0 mg/L、Bti 6.963 8 mg/L，均表現(xiàn)為不同程度的抗藥性(表1)。根據(jù)抗藥性水平判斷標(biāo)準(zhǔn)可知，濟(jì)寧市騷擾庫(kù)蚊幼蟲(chóng)對(duì)其中4種殺蟲(chóng)劑(DDVP、殘殺威、氯氰菊酯、溴氰菊酯)達(dá)到了高度抗性(抗性倍數(shù)分別為117.34、53.47、113.50、140.00)，而對(duì)Bti為低度抗性(抗性倍數(shù)為2.71)。

M為DNA標(biāo)志物(DL 2000)；1為騷擾庫(kù)蚊CQ11基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖2 基因片段擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of gene fragment amplification

圖3 基因片段核苷酸相似性比較Fig.3 Comparison of nucleotide similarity of gene fragments

表1 騷擾庫(kù)蚊對(duì)5種殺蟲(chóng)劑的抗藥性狀況
Tab.1 Resistance ofCulexpipiensmolestusto five insecticides

殺蟲(chóng)劑試蟲(chóng)來(lái)源LC50 (mg/L)回歸方程y=(a+bx)95%CI (mg/L)RRDDVP地下車(chē)庫(kù)11.311 7y=3.821 3+1.118 8x2.520 4～50.766 4117.34敏感品系0.096 4y=5.890 5+0.876 4x0.052 9～0.175 71.00殘殺威地下車(chē)庫(kù)5.859 9y=4.419 2+0.756 4x0.658 0～52.187 853.47敏感品系0.109 6y=6.248 5+1.300 5x0.072 1～0.166 61.00氯氰菊酯地下車(chē)庫(kù)0.022 7y=6.786 6+1.086 4x0.016 1～0.032 0113.50敏感品系0.000 2y=5.931 5+1.313 1x0.000 1～0.000 21.00溴氰菊酯地下車(chē)庫(kù)0.014 0y=6.506 6+0.812 6x0.008 7～0.022 6140.00敏感品系0.000 1y=5.845 3+0.912 0x0.000 1～0.000 21.00Bti地下車(chē)庫(kù)6.963 8y=4.162 6+0.993 5x3.671 2～13.209 82.71敏感品系2.573 4y=4.311 2+1.678 0x1.983 0～3.339 41.00

3 討 論

濟(jì)寧地區(qū)生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，適宜多種蚊蟲(chóng)孳生。隨著濟(jì)寧城市化水平的明顯提高，各種地下基礎(chǔ)設(shè)施(住宅小區(qū)地下室、地下商業(yè)街、地下車(chē)庫(kù)、污水管網(wǎng))建設(shè)規(guī)模逐漸增大，蚊蟲(chóng)的棲息場(chǎng)所和行為受到了很大的影響。本研究首次在山東濟(jì)寧地區(qū)發(fā)現(xiàn)了騷擾庫(kù)蚊孳生場(chǎng)所，并對(duì)騷擾庫(kù)蚊進(jìn)行了抗性水平評(píng)價(jià)。

騷擾庫(kù)蚊與淡色庫(kù)蚊形態(tài)非常相似但是生物學(xué)行為不同，其特點(diǎn)為具有自育性，可在有限的空間內(nèi)交配，缺乏冬季滯育，喜嗜人血，主要生活在封閉或半封閉的地下環(huán)境中[12]。有研究表明，騷擾庫(kù)蚊在不補(bǔ)血的情況下維持10代后，其產(chǎn)卵率并不會(huì)下降，可以持續(xù)維持專(zhuān)性自育，而且在同一實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)的不同種群的騷擾庫(kù)蚊在自育性、繁殖力、生命周期等生活史特征上表現(xiàn)也不同，這些差異可能和騷擾庫(kù)蚊與同域亞種的基因交換引起的遺傳差異有關(guān)[11]。本次蚊蟲(chóng)收集地點(diǎn)的孳生水體位于半地下車(chē)庫(kù)，其與車(chē)庫(kù)外部空間無(wú)直接接觸，整體相對(duì)封閉，適宜騷擾庫(kù)蚊孳生。Gao Q等[13]曾報(bào)道過(guò)上海地區(qū)騷擾庫(kù)蚊在尖音庫(kù)蚊復(fù)合組的比例，露天地上環(huán)境可達(dá)到30%，而在地下棲息地(地下車(chē)庫(kù))的部分地點(diǎn)騷擾庫(kù)蚊構(gòu)成比可達(dá)到100%[14]。張杰等[15]發(fā)現(xiàn)上海市楊浦區(qū)的全封閉型小空間地下車(chē)庫(kù)內(nèi)的蚊蟲(chóng)均為騷擾庫(kù)蚊，全封閉型大空間地下車(chē)庫(kù)內(nèi)，騷擾庫(kù)蚊的比例可達(dá)54.09%，而在半封閉型地下車(chē)庫(kù)環(huán)境中，騷擾庫(kù)蚊數(shù)量較少。因此，他們認(rèn)為地下車(chē)庫(kù)內(nèi)的蚊種與其孳生水體的密閉程度有關(guān)，越密閉則騷擾庫(kù)蚊的比例越高，反之，淡色庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊的比例增高。

研究表明，騷擾庫(kù)蚊作為西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)的傳播媒介，其特殊的生物學(xué)行為使其能夠在冬季存活下來(lái)。WNV通常在鳥(niǎo)類(lèi)和蚊子間循環(huán)傳播，人主要通過(guò)被蚊蟲(chóng)叮咬而感染。WNV傳入北美后的嚴(yán)峻的流行形勢(shì)，突顯了外來(lái)的蟲(chóng)媒病毒對(duì)本地區(qū)潛在的公共衛(wèi)生威脅，冬季存活下來(lái)并且攜帶病毒的騷擾庫(kù)蚊可能為春季北美西尼羅熱疫情快速蔓延的關(guān)鍵因素[14,16]。中國(guó)新疆地區(qū)發(fā)現(xiàn)尖音庫(kù)蚊體內(nèi)有WNV的存在及WNV造成的相關(guān)病毒性腦炎的流行[17]，而且我國(guó)存在著大量可以攜帶WNV的蚊類(lèi)，全球候鳥(niǎo)遷徙的路線(xiàn)有3條經(jīng)過(guò)中國(guó)[18]，隨著中國(guó)與世界其他各國(guó)之間人員往來(lái)的頻繁，WNV在濟(jì)寧甚至中國(guó)北方地區(qū)流行的可能性是存在的。在地表水匱乏的旱季，傳播媒介78%可能來(lái)自地下棲息地[19]，因此，騷擾庫(kù)蚊是研究WNV等蟲(chóng)媒病毒的良好媒介[20]。

騷擾庫(kù)蚊對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性情況在國(guó)內(nèi)報(bào)道很少，姬淑紅等[21]研究了上海地區(qū)騷擾庫(kù)蚊對(duì)多種殺蟲(chóng)劑的抗性水平，結(jié)果顯示騷擾庫(kù)蚊對(duì)溴氰菊酯抗性倍數(shù)為192.59，與本次測(cè)試結(jié)果的抗性水平相當(dāng)。1980年以來(lái)，由于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)危害嚴(yán)重，擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治。其他殺蟲(chóng)劑如氨基甲酸酯和有機(jī)磷，自1990年以來(lái)也在該地被使用。騷擾庫(kù)蚊一般生長(zhǎng)在地下水系中，其與殺蟲(chóng)劑接觸的機(jī)會(huì)可能因棲息環(huán)境類(lèi)型而與淡色庫(kù)蚊不同。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與2015年濟(jì)寧城區(qū)淡色庫(kù)蚊抗藥性[22]相比，擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)抗性水平下降，但殘殺威和DDVP的抗性水平有所上升。與同期淡色庫(kù)蚊抗性相比，騷擾庫(kù)蚊殘殺威和DDVP的抗性水平也較高，但溴氰菊酯和氯氰菊酯抗性水平相當(dāng)[23]。殺蟲(chóng)劑的使用在蚊蟲(chóng)綜合治理和蚊媒疾病控制中做出了巨大貢獻(xiàn)，化學(xué)殺蟲(chóng)劑使用方便，殺滅效果快，作用強(qiáng)且持久，但易產(chǎn)生環(huán)境污染和使蚊蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性問(wèn)題。Bti作為生物殺蟲(chóng)劑，因其對(duì)環(huán)境友好，不易使蚊蟲(chóng)產(chǎn)生交互抗性和對(duì)蚊幼殺滅作用顯著從而使用頻率和范圍逐漸增大。本次研究結(jié)果顯示，騷擾庫(kù)蚊對(duì)Bti為敏感水平，在未來(lái)控制騷擾庫(kù)蚊孳生地時(shí)可以?xún)?yōu)先使用該種殺蟲(chóng)劑以達(dá)到較好的滅蚊幼效果。

城市化發(fā)展的過(guò)程中，蚊蟲(chóng)的分布、種類(lèi)和密度也將發(fā)生變化。騷擾庫(kù)蚊與城市環(huán)境密切相關(guān)，隨著該物種在越來(lái)越多的地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，我們有必要對(duì)該物種的生物學(xué)特點(diǎn)和抗藥性水平進(jìn)行深入了解，特別是作為蚊媒疾病載體的研究有助于評(píng)估該種蚊蟲(chóng)潛在的流行病學(xué)意義。對(duì)于騷擾庫(kù)蚊在內(nèi)的尖音庫(kù)蚊復(fù)合組的吸血習(xí)性的研究，可以揭示引起吸血性和非吸血性蚊蟲(chóng)的關(guān)鍵差異點(diǎn)，為研發(fā)新型高效殺蟲(chóng)劑提供理論依據(jù)。針對(duì)于目前的情況我們提出以下幾點(diǎn)建議： 1)騷擾庫(kù)蚊防治以綜合治理為主，針對(duì)于該蚊易棲息的封閉或半封閉場(chǎng)所加強(qiáng)環(huán)境整治，減少孳生地。2)加強(qiáng)蚊媒監(jiān)測(cè)，根據(jù)當(dāng)?shù)匚妹郊膊“l(fā)生和流行的特點(diǎn)，分析可能傳播的蚊媒疾病并有針對(duì)性地控制蚊蟲(chóng)密度，從而制定科學(xué)、合理、有效的防治措施。3)孳生地通過(guò)采用生物殺蟲(chóng)劑或生物防治的方法可以減緩蚊蟲(chóng)抗藥性的發(fā)展。

利益沖突：無(wú)