新布尼亞病毒真核表達載體的構建及表達

竇麗麗，陶曉莉，王曉芳，李婷婷，李永剛

近年來，我國新發現了一種新型布尼亞病毒，經蜱傳播，其臨床表現主要為發熱、血小板和白細胞減少、胃腸道癥狀以及淋巴結腫大，嚴重時還會引起器官衰竭，故將此病毒命名為發熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒，該病毒引起的疾病稱為嚴重發熱伴血小板減少癥(SFTS)，是一種人獸共患病[1]。該病毒被世界衛生組織列為引起嚴重發熱的最危險病原體,其死亡率為12%～30%，同時伴有特征性血小板減少癥[2]。然而，目前還沒有針對此種病毒的抗病毒藥物或者疫苗，另外該病毒在人類中的發病機制及病毒與宿主的相互作用在很大程度上仍未可知[3]。布尼亞病毒是最大的動物病毒家族之一，大約有350種病毒，其中大多數是蟲媒病毒，由節肢動物或嚙齒動物傳播。不同的布尼亞病毒感染者表現出一系列輕度至重度疾病，即發熱性疾病，腦炎，出血熱和急性呼吸道疾病[1]。 由于宿主的廣泛性和物種的多樣性，布尼亞病毒引起了廣泛的關注。

研究表明，SFTSV-NSs是一個強的干擾素(IFN)拮抗劑，其可以阻斷SFTSV感染細胞中IFN生成并且NSs是病毒毒力的主要決定因素[4-9]。一些專家學者嘗試產生缺乏NSs結構的缺陷型病毒以促進該發病機理的研究及開發新的候選疫苗，以防止這種重要的新興病原體的傳播。NSs在SFTSV病毒復制周期中具有重要作用，而該病毒在人類中的發病機制及病毒與宿主的相互作用仍不十分明確，本研究通過克隆SFTSV-NSs基因，構建其真核表達質粒以及檢測其在細胞中的表達，為進一步研究SFTSV-NSs基因的結構和功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1病毒與細胞 本實驗所用的SFTSV由中國醫學科學院微生物所饋贈，293細胞株購于北京協和醫學院細胞中心。

1.1.2主要試劑 內切酶EcoRI酶、XhoⅠ酶(Thermo Scientific)；反轉錄試劑盒、DH5α感受態細胞等(TaKaRa 公司)；TRIzol Reagent LS(Ambion)；質粒DNA中量試劑盒(美國Axyprep公司);DMEM培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；抗FLAG單克隆抗體(Sigma公司)；Alexa Flour 594 goat anti-mouse IgG (H+L)、HRP-goat anti-mouse IgG (H+L) (Invitrogen公司)等。

1.2 SFTSV-NSs基因真核表達載體的構建

1.2.1引物設計與合成 根據GenBank提供的SFTSV-NSs序列，運用Premier 5.0軟件，進行引物的設計。設計引物時，選取合適的酶切位點，設計真核表達重組質粒的引物見表1。

表1 新布尼亞病毒SFTSV-NSs基因真核表達引物
Tab.1 Eukrainian virus SFTSV-NSs gene eukaryotic expression primer

名稱序列產物長度/bpSFTSV-NSs R(BamHI)CGGGATCCTTAGACCTCCT-TCGGGAGGTCACCAATG877SFTSV-NSs F(EcoRI)CGGGATCCTTAGACCTCCT-TCGGGAGGTCACCAATG877

注：設計好的引物由大連寶生物公司合成，純化級別為PAGE級。

1.2.2SFTSV RNA的提取及SFTSV-NSs基因PCR 擴增 SFTSV RNA按照Invitrogen公司的TRIzol Reagent LS 試劑說明書進行的提取，后經反轉錄合成病毒cDNA。通過PCR 擴增得SFTSV-NSs基因。PCR 程序為94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸65 s，擴增35個循環; 72 ℃ 延伸10 min。PCR擴增產物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3重組質粒pSFTSV-NSs-FLAG構建和鑒定

將PCR擴增產物進行通過純化試劑盒進行純化，并取適量PCR純化產物送去公司測序。將純化得到的SFTSV-NSs cDNA 片段連接到pFLAG-CMV-3載體，將連接產物轉化大腸桿菌 DH5α感受態細胞選擇生長良好的單克隆擴大培養后進行質粒中量提取，并用分光光度儀測定提取的質粒濃度，將提取的重組質粒用EcoRI/BamHI進行雙酶切鑒定。

1.3pSFTSV-NSs-FLAG轉染人腎上皮細胞293及相關檢測

1.3.1293細胞培養及轉染 將293細胞以4×105/孔的密度接種到置有爬片的24孔板中，加入配好的含10%胎牛血清的高糖培養基置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜。次日每孔用50 μL Opti-MEM稀釋2 μL PEI轉染試劑，輕輕吹吸3～5次混合均勻，室溫放置5 min。用50 μL Opti-MEM稀釋pSFTSV-NSs-FLAG質粒0.8 μg，同時稀釋空載體pFLAG-CMV-3設置為對照組；將稀釋好的質粒與空載體分別加入到PEI稀釋液中，室溫放置20 min。將混合液逐滴加入到24孔板中，置于37 ℃細胞培養箱中培養48 h。分別進行間接免疫熒光及Western Blot檢測。

1.3.2免疫熒光檢測 293細胞轉染pSFTSV-NSs-FLAG質粒48 h后，用4%多聚甲醛固定液固定1 h，PBS洗滌3次。然后0.1% Triton X-100打孔10 min，用PBS洗滌3次后再加入含2% FBS的PBS封閉液，4 ℃封閉2 h。用PBS洗滌3次后加入小鼠抗FLAG抗體，37 ℃孵育1 h。吸掉一抗稀釋液，用PBS洗滌3次，加入二抗Alexa Flour 594 goat anti-mouse IgG (H+L)，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，每孔加入100 μL DAPI溶液室溫孵育5 min，PBS洗滌3次，用甘油進行封片，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.3Western blot檢測重組質粒轉染的293細胞中SFTSV-NSs蛋白表達 用細胞裂解液NP-40提取轉染后293細胞的總蛋白，加入 4×蛋白上樣緩沖液置于沸水浴中加熱10 min進行蛋白變性，所得樣本收集置于-20 ℃凍存備用。蛋白樣品回收后轉膜，5% 脫脂奶粉封閉2 h; 將小鼠抗FLAG抗體用1∶5 000比例稀釋，4 ℃ 搖床孵育過夜; 然后用洗膜液5 min/次洗膜3次。再以1∶3 000的比例稀釋HRP-goat anti-mouse IgG (H+L)作為二抗，室溫搖床孵育1 h，再用洗膜液5 min/次洗膜3次。最后用化學發光法分別檢測PVDF膜上SFTSV-NSs蛋白的表達。

2 結 果

2.1SFTSV-NSs基因擴增序列測定 PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果如圖1，在877 bp左右有條帶，與預期SFTSV-NSs基因大小一致，因此判斷SFTSV-NSs真核表達基因擴增成功，且條帶單一，可以進行PCR產物純化。

注：1和2均為SFTSV-NSs目的片段圖1 SFTSV-NSs基因PCR產物電泳結果Fig.1 SFTSV-NSs gene PCR product electrophoresis results

2.2重組質粒構建及測序鑒定 用EcoRI/BamHI雙酶切真核PCR純化產物和空載體pFLAG-CMV-3質粒，回收目的片段并連接，用EcoRI/BamHI雙酶切鑒定。電泳顯示有和預期大小一致的酶切片段，證明pSFTSV-NSs-FLAG質粒構建成功，見圖2。

注：1和2均為pSFTSV-NSs-FLAG質粒圖2 EcoRI/BamHI雙酶切pSFTSV-NSs-FLAG質粒Fig.2 EcoRI/BamHI double digestion of pSFTSV-NSs-FLAG plasmid

2.3免疫熒光檢測SFTSV-NSs基因在293細胞中的定位 pSFTSV-NSs-FLAG轉染至293細胞中，以抗FLAG標簽的單克隆抗體為一抗進行間接免疫熒光檢測。結果如圖3所示，轉染的293細胞質內檢測到熒光聚集的類包涵體樣結構，但細胞核內無表達；而轉染pFLAG-CMV-3空載體的細胞未檢測到熒光標記。

注：A為轉染空載體pFLAG-CMV-3；B為轉染重組質粒pSFTSV-NSs-FLAG圖3 pSFTSV-NSs-FLAG轉染細胞間接免疫熒光檢測(200×)Fig.3 Indirect immunofluorescence detection of pSFTSV-NSs-FLAG transfected cells (200×)

2.4Western blot 鑒定目的蛋白在293細胞中的表達 pSFTSV-NSs-FLAG轉染至293細胞中，Western Blot檢測結果如圖4所示。由圖可見pSFTSV-NSs-FLAG轉染后的細胞提取總蛋白的泳道中在約33 kD處有特異性條帶出現，與SFTSV-NSs蛋白預期大小一致，而轉染空載體pFLAG-CMV-3的泳道則沒有條帶。

注：1為轉染空載體；2-4為轉染pSFTSV-NSs-FLAG質粒圖4 pSFTSV-NSs-FLAG轉染細胞Western Blot檢測Fig.4 pSFTSV-NSs-FLAG transfected cells were detected by Western Blot

3 討 論

布尼亞病毒之所以種類繁多，是由于其基因組的分節段特性，利于病毒發生基因重排和基因重組，既可對變化的環境獲得適應性突變，也可快速產生新病毒，增加致病性。基因重排和基因重組本質上增大了布尼亞病毒對宿主的危害，為布尼亞病毒診斷、預防及控制加大了難度，從而對人類公共衛生造成了更大的威脅[10-12]。因此，對重要的布尼亞病毒要求進行深入研究，探究其遺傳機制、傳播機制及驅動基因重排的機理，從而為此類病毒的預防與控制提供理論基礎。

SFTSV屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，為分節段的負鏈RNA病毒，病毒顆粒呈球形，直徑80～100 nm，由厚度5～7 nm的脂質雙層覆蓋，其表面有棘突。與其他白蛉屬病毒類似，SFTSV基因組分為L、M、S 3個片段，S片段編碼核蛋白(NP)和非結構蛋白(NSs)[13]。Brennan B等[14]發現SFTSV病毒致病性的增強是由于NSs對先天免疫反應的拮抗作用，并且他們進一步證實編碼NSs核苷酸序列的某些部分對于重組病毒的回收可能是至關重要的。在體內環境中，SFTSV-NSs拮抗IFN反應的能力可能限于I型干擾素誘導和信號傳導。NSs蛋白可以在感染和轉染的細胞中形成病毒樣結構(VLS),受感染細胞中的結構蛋白可能與病毒RNA相互作用[15]。本研究通過轉染構建的病毒重組質粒，經免疫熒光檢測也觀察到類包涵體樣結構，與其研究結果一致。以上數據表明NSs也可能在病毒復制中發揮重要作用[17]。另外，有研究表明，NSs蛋白可能在病毒復制中發揮重要作用，但具體作用機制尚不清楚。本研究通過構建SFTSV-NSs真核表達體 pSFTSV-NSs-FLAG并將其轉染293細胞，進而通過研究重組質粒在細胞中的表達情況，為進一步研究SFTSV-NSs基因的結構和功能奠定基礎，以期為研究SFTSV在感染細胞過程中與宿主的相互作用提供新思路。

利益沖突：無