三七總皂苷結合針灸干預對急性缺血性腦卒中大鼠血腦屏障的保護作用及對PI3K/Akt信號通路的影響?

劉 禹 邵海宇 王 琦

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省齊齊哈爾市第一醫院，黑龍江齊齊哈爾 161005）

腦卒中是由于腦部血管發生破裂或阻塞，導致血液不能進入大腦相應組織，引起腦組織缺血缺氧而導致的一類腦部疾病［1］。腦卒中是全球范圍內第二大致死性原因，同時也是引起殘疾的主要原因之一，具有高發病率、高死亡率、高致殘率以及高復發率的特點，成為一項全球性的公共衛生問題［2-3］。目前針對急性缺血性腦卒中臨床治療方式主要包括藥物治療（溶栓藥物、神經保護劑）以及手術治療（機械血栓去除術），然而由于治療時間窗狹窄、臨床副作用大以及并發癥風險高等原因，使其在臨床中的應用屢遭瓶頸［4］。三七總皂苷（PNS）是五加科植物三七的一種主要有效活性成分，含有多種單體皂苷。藥理學相關研究顯示［5-6］，三七總皂苷具有擴張血管、抑制血小板凝集、降低心肌耗氧量、降血脂、清除氧自由基以及抗炎、抗氧化等相關作用；此外，有學者研究證實［7］，在急性缺血性腦卒中患者中使用三七總皂苷與阿替普酶溶栓治療，可降低患者溶栓過程中的出血性轉化風險，而關于三七總皂苷對血腦屏障保護作用及其機制目前仍未闡明。針灸治療缺血性腦卒中患者已經取得了良好的臨床療效，且學者認為在腦卒中后偏癱治療中早期針刺治療，可促進肢體功能的康復，改善患者臨床預后［8-9］。本研究探討分析PNS結合針灸治療急性缺血性腦卒中大鼠血腦屏障保護作用及對大鼠PI3K/Akt信號通路的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠，體質量250～300 g，購于中國醫學科學院實驗動物研究所，實驗動物許可證：SCXK（京）2005-0013。溫度20～25℃，濕度40%～50%，自由飲食、水。

1.2 試藥與儀器

PNS（昆藥集團股份有限公司），使用0.9%氯化鈉注射液配制為質量濃度1 mg/mL的溶液備用；伊文思藍（EB）（美國Sigma公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo公司）；maker預染蛋白（美國Thermo公司）；HRP辣根過氧化物酶標記二抗（北京中杉金橋公司）；兔抗鼠PI3K單克隆抗體（美國Abcam公司）；兔抗鼠Akt單克隆抗體（美國Abcam公司）；ECL發光試劑盒（美國Pierce公司）；G6805型電針治療儀（蘇州醫療用品廠有限公司）；一次性針灸針（蘇州華佗牌，直徑0.2mm，針身長0.5寸）；多功能酶標儀（美國BioTek公司）。

1.3 造模及分組

將大鼠隨機分為4組，分別是假手術組、模型組、針灸組、PNS+針灸組，每組各15只。采用Zea Longa線栓法［10］制作大鼠缺血性腦卒中模型，使用4%恩氟烷誘導麻醉，1%～2%恩氟烷混合70%N2O和30%O2維持麻醉，術中小心分離大鼠右側頸總動脈、頸內動脈以及頸外動脈，使拴線從大鼠頸外動脈殘端插入頸內動脈，直至距頸外動脈與頸內動脈分叉處1.8 cm處停止。線栓停留1.5 h后拔除栓子，制備缺血/再灌注損傷模型。假手術組大鼠僅分離上述血管，而不插入栓線。缺血1.5 h后拔除線栓，將大鼠尾部提起，可見大鼠左側前肢屈曲則視為造模成功。采用差額補充法保證每組實驗大鼠的例數。

1.4 干預方法

1）針灸組：造模成功后將不予麻醉的大鼠固定在鼠夾上，根據華興邦等制定的大鼠針灸穴位進行定位，選取百會、水溝、雙側內關以及雙側三陰交。采用捻轉、提插補瀉刺激雙側內關1 mm，強刺激1 min，留針30 min；采用雀啄法有鼻中隔下部向上斜刺水溝1 mm，強刺激1 min；然后再應用提插法直刺三陰交5 mm，持續1 min，留針30 min；最后針刺百會穴，取向后斜刺2 mm，采用平補平瀉捻轉法刺激1 min，留針30 min。留針期間，使用G6085電針治療儀連接內關與三陰交穴位針柄，調整電壓2～4 V，給予疏密波，刺激強度以針刺部位輕微抖動。第1次針刺在造模成功后24 h內進行，以后每天固定時間針刺1次，7 d為1個療程。2）PNS+針灸組：術前10 min給予PNS 10 mg/kg尾靜脈注射，術后24 h內開始針灸治療，治療方法同針灸組，持續治療14 d，每次針灸治療完成后30 min，給予PNS 10 mg/kg尾靜脈注射。3）假手術組與模型組：抓取、固定方法同針灸組，但不進行針刺。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 大鼠行為學評分比較 分別于術后24 h、術后3 d、術后7 d對各組大鼠進行神經行為學評分。0分：大鼠無神經缺損癥狀。1分：提起大鼠尾部后，左側前爪不能完全伸展。2分：爬行時大鼠向左側轉圈。3分：大鼠行走困難且向左側傾倒。4分：大鼠無法自發行走且意識喪失。

1.5.2 血腦屏障通透性 各組大鼠完成治療后，每組5只大鼠測定血腦屏障通透性。經微靜脈注射EB 4 mL/kg，使其在體內循環2 h后，麻醉，經左心室灌注0.9%氯化鈉注射液300 mL，取各組大鼠大腦左右半球進行稱量，加入2 mL甲酰胺勻漿后置于54℃條件下溫育2 h，離心20 min（12 000 g）。采用紫外分光光度計檢測620 nm波長處的吸光度，使用EB標準曲線濃度計算各組大鼠腦組織中EB含量。

1.5.3 腦組織含水量測定 各組大鼠完成治療后，每組5只大鼠測定腦組織含水量，取大鼠大腦左右半球稱質量，120℃烤箱烘烤12 h，測量大腦干濕重比，干濕重比=（濕重-干重/濕重）×100%。

1.5.4 Wesren blotting法檢測大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白表達 各組大鼠完成治療后，每組使用5只大鼠測定腦組織PI3K、Akt蛋白表達，取大鼠右側大腦組織用于目的蛋白的表達檢測，用冰0.9%氯化鈉注射液漂洗腦組織清除血液后拭干。取100 mg腦組織，加入細胞裂解液勻漿。離心后取上清，采用BCA蛋白分析法測定蛋白濃度，然后使用懸浮緩沖液調整蛋白濃度。加入等體積加樣緩沖液后混合均勻，水浴煮沸5 min。取含20 μg蛋白的樣品上樣進行SDS-PAGE電泳分離，然后電轉印到PVDF膜上。加入5%脫脂奶粉封閉液37℃封閉1 h，將PVDF膜置于雜交袋內，加入適當稀釋后的一抗封閉液，4℃下孵育過夜；PBST漂洗PVDF膜后，常溫二抗孵育1 h，再次漂洗。將ECL液滴于PVDF膜上作用1 min，置于X線片盒中，曝光2～5 min顯影、定影、水洗、晾干。將X線片使用掃描儀掃描，并應用Quantity One軟件對各組光密度值進行分析。將目標蛋白光密度值與β-actin光密度值的比值作為目標蛋白相對表達量。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠行為學評分比較

見表1。術后24 h、術后3 d、術后7 d各腦卒中組大鼠神經行為學評分顯著高于假手術組（P＜0.05），術后24 h各腦卒中組大鼠神經行為學評分相當（P＞0.05），而術后3 d、術后7 d針灸組、PNS+針灸組大鼠神經行為學評分較模型組顯著降低（P＜0.05），且PNS+針灸組大鼠神經行為學評分顯著低于針灸組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠行為學評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠行為學評分比較（分，±s）

與假手術組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與針灸組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術組模型組針灸組PNS+針灸組n 15 15 15 15術后24 h 0.00±0.00 3.02±0.35*2.97±0.43*3.08±0.39*術后3 d 0.00±0.00 2.91±0.24*2.62±0.27*#2.41±0.19*#△術后7 d 0.00±0.00 2.77±0.41*2.30±0.33*#2.07±0.25*#△

2.2 各組大鼠血腦屏障通透性比較

見表2。各組大鼠左腦組織EB含量相當（P＞0.05），各腦卒中組大鼠右腦組織EB含量顯著高于假手術組（P＜0.05），其中針灸組與PNS+針灸組大鼠右腦組織EB含量較模型組顯著降低（P＜0.05），而PNS+針灸組大鼠右腦組織EB含量顯著低于針灸組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦組織EB含量比較（mg/g，±s）

表2 各組大鼠腦組織EB含量比較（mg/g，±s）

組別假手術組模型組針灸組PNS+針灸組n 5 5 5 5 EB含量（左腦）8.12±2.03 8.42±1.97 8.31±2.14 8.36±2.08 EB含量（右腦）8.35±2.10 25.63±4.11*19.89±4.52*#16.70±3.96*#△

2.3 各組大鼠腦組織含水量比較

見表3。各組大鼠左腦組織含水量相當（P＞0.05），各腦卒中組大鼠右腦組織含水量顯著高于假手術組（P＜0.05），其中針灸組與PNS+針灸組大鼠右腦組織含水量較模型組顯著降低（P＜0.05），而PNS+針灸組大鼠右腦組織含水量顯著低于針灸組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腦組織含水量比較（%，±s）

表3 各組大鼠腦組織含水量比較（%，±s）

組別假手術組模型組針灸組PNS+針灸組n 5 5 5 5含水量（左腦）77.95±0.92 78.12±1.21 78.01±1.68 78.42±1.83含水量（右腦）78.32±1.02 85.64±1.17*#83.08±0.95*#80.22±0.99*#△

2.4 各組大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白表達比較

見表4，圖1。各腦卒中組大鼠腦組織PI3K、Akt表達水平均較假手術組顯著升高（P＜0.05），其中針灸組以及PNS+針灸組大鼠腦組織PI3K較模型組顯著升高（P＜0.05），且PNS+針灸組大鼠腦組織PI3K表達顯著高于針灸組（P＜0.05）；而模型組、針灸組以及PNS+針灸組大鼠腦組織Akt表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白相對表達量比較（±s）

組別假手術組模型組針灸組PNS+針灸組n 5 5 5 5 PI3K 0.513±0.042 0.683±0.029*0.819±0.031*#1.281±0.045*#△Akt 1.123±0.061 1.204±0.042*1.191±0.054*1.218±0.048*

圖1 各組大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白表達

3 討論

缺血性腦卒中屬于中醫學“中風”范疇，其病機多為陰陽失調、血氣運行受阻、血瘀滯絡等［11］。針灸治療，包括頭皮針以及電針等治療，由于其具有簡便、經濟且療效確切的臨床優點，被廣泛用于臨床腦卒中患者康復過程，本研究采取“醒腦開竅”針刺法進行動物方面研究驗證［12-13］。

關于PNS治療腦血管病方面神經保護機制，目前已經有相關研究報道［14-15］，其中主要集中在PNS抗氧化、抗血管損傷以及抗血小板聚集方面，而關于PNS對血腦屏障的影響及其機制，尚無相關報道。此外，藥物聯合針灸治療缺血性腦卒中一直是臨床關注的焦點，以更好地提高患者臨床療效、降低患者殘疾率以及病死率，以改善患者臨床預后［16］。本研究從實驗動物入手，探討分析PNS結合針灸治療急性缺血性腦卒中大鼠血腦屏障保護作用及對PI3K/Akt信號通路的影響。

本研究結果顯示，術后3 d、術后7 d針灸組以及PNS+針灸組大鼠神經行為學評分較模型組顯著降低，同時PNS+針灸組大鼠神經行為學評分顯著低于針灸組。結果提示采取針灸、聯合三七總皂苷治療后，可有效改善大鼠腦卒中后神經行為學，與臨床相關報道相似［17］。藥物聯合針灸治療是腦卒中患者早期康復的重要措施之一，有助于患者治療后肢體功能的恢復，降低患者致殘率。各腦卒中組大鼠右腦組織EB含量以及腦組織含水量均較假手術組顯著升高，而針灸組以及PNS+針灸組大鼠右腦組織EB含量以及腦組織含水量較模型組有所降低，其中PNS+針灸組大鼠顯著低于針灸組。血腦屏障是分割血液與大腦的一種復雜屏障系統，在腦缺血后，可引發血管內皮損傷，細胞外基質破壞，從而引起血腦屏障完整性的破壞，導致血腦屏障通透性增加且發生血源性腦水腫［18］。從本研究來看，缺血性腦卒中模型制作后，可提高大鼠血腦屏障通透性同時增加腦組織含水量，進一步證實腦卒中對血腦屏障的破壞作用。此外，采取針灸治療或聯合PNS治療均可有效降低大鼠血腦屏障通透性同時降低腦水腫程度，發揮血腦屏障保護作用，其中PNS聯合針灸治療對腦卒中大鼠血腦屏障的保護作用更佳。

PI3K/Akt信號通路是腦缺血和神經系統凋亡轉導的重要通路之一。研究顯示，大多數神經營養因子均可激活PI3K/Akt信號通路，對神經凋亡產生抑制作用，發揮神經保護、減輕血源性腦水腫的發生［19-20］。國外學者對大鼠進行缺血預處理［21］，結果顯示，缺血預處理可延長腦缺血發生后PI3K/Akt信號活化持續時間，從而在腦缺血耐受中發揮著重要作用。本研究中，各腦卒中大鼠PI3K、Akt蛋白表達量均較假手術組顯著升高，針灸組、PNS+針灸組大鼠PI3K蛋白表達量較模型組明顯升高，其中PNS+針灸組大鼠升高程度更為明顯；而針灸組、PNS+針灸組大鼠與模型組比較，Akt蛋白表達量無明顯變化。提示腦卒中發生后，可導致腦組織PI3K/Akt信號通路的激活，這可能是機體神經保護代償性作用之一，而有效的治療可進一步促進該通路的激活程度，以進一步發揮神經保護作用。而關于治療后Akt蛋白表達與模型組無差異，可能由于實驗樣本量較小或腦卒中后檢驗時間較長等因素有關。

綜上所述，PNS聯合針灸治療急性缺血性腦卒中大鼠具有顯著的血腦屏障保護作用，可有效改善大鼠神經行為學狀況，其作用機制可能與促進PI3K/Akt信號通路的激活有關。