鱉甲生血丸對骨髓纖維化大鼠作用機制的實驗研究※

吳維海 袁 煒 李建英 張振會 白艷輝

(河北省石家莊平安醫院血液科，河北 石家莊 050021)

骨髓纖維化是骨髓增殖性腫瘤的一種，主要是由于骨髓中膠原組織沉積、纖維組織增生，進而導致骨髓正常的造血功能受到影響所引起的一種疾病[1]。現代醫學研究認為，骨髓纖維化與肝纖維化的發病機制具有相似性，骨髓纖維化、肝纖維化以及肺纖維可以被認為是同一病理類型在不同靶器官的表現，50%～70%的骨髓纖維化患者合并肝大，10%～20%合并肝硬化，病理均提示肝纖維化[2-3]。目前，臨床上對骨髓纖維化的發病機制進行了深入研究，多種細胞生長因子被認為在骨髓纖維化過程中發揮了重大作用，其中以血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子β(TGF-β1)及血管內皮生長因子(VEGF)的研究最為廣泛[4-5]。鱉甲生血丸是我們臨床治療骨髓纖維化的經驗方，先前研究表明其對骨髓纖維化具有確切療效[6]。為進一步探討鱉甲生血丸治療骨髓纖維化的作用機制，我們通過建立肝纖維化大鼠模型(目前建立骨髓纖維化動物模型的成功率較低，尚不具備實驗條件)，觀察鱉甲生血丸對大鼠肝組織羥脯氨酸(Hyp)含量變化，肝細胞損傷程度分級和肝維纖化程度分級變化，以及血清PDGF、TGF-β1及VEGF水平的影響，探討其治療骨髓纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠72只，體質量180～240 g，周齡6～7周，飼養環境溫度20～24 ℃，相對濕度40%～60%，實驗期間自由飲食、飲水，購于河北省實驗動物中心，動物合格證號：1119069。

1.2 主要藥物及試劑 鱉甲生血丸(主要由醋鱉甲、炒桃仁、水蛭、三棱、熟大黃、熟地黃、紫河車、三七及甘草組成，由河北省石家莊平安醫院制劑室制成丸劑)研磨后用蒸餾水調配成濃度分別為0.07、0.14、0.28 g/mL的藥液備用；肝復康丸(陜西華西制藥股份有限公司，國藥準字Z20003377)。四氯化碳(天津市河東區紅巖試劑廠)；PDGF、TGF-β1及VEGF的酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒(上海森雄科技實業有限公司)。

1.3 主要儀器 安圖PHOMO酶標儀(安圖實驗儀器有限公司)；恒溫水浴箱(山東濰坊精鷹醫療器械有限公司)；奧林巴斯CX31生物顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備 將72只SD大鼠按隨機數字表法分為正常對照組、模型對照組、鱉甲生血丸低劑量組、鱉甲生血丸中劑量組、鱉甲生血丸高劑量組及肝復康丸組，每組12只。除正常對照組外，其余5組均進行肝纖維化模型制備，即實驗第1 d予100%四氯化碳0.5 mL/100 g于大鼠后腿皮下注射，以后每周一和周四按0.3 mL/100 g注射40%四氯化碳豆油溶液，共連續注射9周[7]。

1.4.2 給藥方法 從造模開始的第5周，正常對照組及模型對照組予蒸餾水1 mL/100 g灌胃，每日1次。鱉甲生血丸低、中、高劑量組分別予鱉甲生血丸1 mL/100 g(生藥含量分別為0.07、0.14、0.28 g/mL)的藥液灌胃，每日1次。肝復康丸組予肝復康丸0.42 g/100 g灌胃，每日1次。各組大鼠均連續灌胃5周。

1.4.3 標本采集 各組大鼠在末次灌胃前均禁食12 h，末次灌胃2 h后給予3%戊巴比妥鈉0.2 mL/100 g腹腔注射麻醉后，脫頸處死。抽取頸總動脈血1 mL，分離血清待檢，并切除肝臟組織送檢病理。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 一般情況 觀察各組大鼠實驗期間的一般情況，包括進食、飲水、活動、體質量增長及死亡情況。

1.5.2 肝組織羥脯氨酸(Hyp)含量檢測 各組大鼠均取適量肝臟組織，參照文獻[8]中的檢測方法對大鼠肝臟組織中Hyp含量進行測定，進而對肝纖維化造模情況進行評估。

1.5.3 血清PDGF、TGF-β1及VEGF檢測 血清PDGF、TGF-β1及VEGF的檢測均采用ELISA法[9]，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5.4 組織病理學觀察 將剩余肝臟組織用10%甲醛溶液固定48 h，然后常規進行石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅(HE)法染色，在生物顯微鏡下觀察肝小葉、肝細胞變化情況，以及纖維組織增生情況。肝細胞損傷程度的分級標準：①“-”，正常肝組織；②“+”，肝細胞變性范圍沒有超過肝小葉半徑的1/2，以水變性為主，肝細胞呈點狀或小灶狀壞死，匯管區炎癥細胞浸潤；③“++”，肝細胞變性范圍超過了肝小葉半徑的1/2，但沒有超過2/3，以氣球樣變性為主，較多肝細胞呈碎片狀壞死，匯管區大量炎癥細胞浸潤；④“+++”，肝細胞變性壞死范圍超過肝小葉半徑的2/3，以碎片狀、橋接狀壞死為主[10]。肝纖維化程度采用Metavir評分系統的分級標準：①F0，無纖維化；②F1，匯管區纖維性擴大，但沒有纖維間隔形成；③F2，匯管區纖維性擴大，少數纖維間隔形成；④F3，多數纖維間隔形成，但沒有硬化結節；⑤F4，肝硬化[11]。

2 結 果

2.1 各大鼠一般狀況 正常對照組12只大鼠進食、飲水、活動及體質量增長情況均無異常，均存活至實驗結束；模型對照組大鼠死亡5只，其余7只大鼠進食、飲水、活動及體質量增長情況較正常對照組大鼠均減少；鱉甲生血丸低、中、高劑量組大鼠分別有3、2、2只死亡，肝復康組大鼠有3只死亡，其余存活至實驗結束的大鼠進食、飲水、活動及體質量增長情況較模型對照組均有好轉。

2.2 各組大鼠灌胃5周后肝組織Hyp含量比較 見表1。

由表1可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠灌胃5周后肝組織Hyp含量升高，比較差異有統計學意義(P<0.05)，提示肝纖維化模型造模成功。與模型對照組比較，鱉甲生血丸中、高劑量組及肝復康丸組灌胃5周后肝組織Hyp含量均下降，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，但各組組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。鱉甲生血丸低劑量組大鼠灌胃5周后肝組織Hyp含量較模型對照組雖然也有下降趨勢，但比較差異無統計學意義(P>0.05)。

組 別nHyp正常對照組120.117±0.005模型對照組70.414±0.111?鱉甲生血丸低劑量組90.326±0.101鱉甲生血丸中劑量組100.268±0.106△鱉甲生血丸高劑量組100.246±0.083△肝復康丸組90.259±0.095△

與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05

2.3 各組大鼠灌胃5周后血清PDGF、TGF-β1及VEGF水平情況比較 見表2。

由表2可見，與正常對照組比較，模型對照組灌胃5周后血清PDGF、TGF-β1及VEGF水平均升高，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組比較，鱉甲生血丸低、中、高劑量組及肝復康丸組大鼠灌胃5周后血清PDGF、TGF-β1及VEGF水平均下降，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，但各組組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

組 別nPDGF(ng/L)TGF-β1(ng/mL)VEGF(μg/L)正常對照組12808.92±161.18168.72±31.41120.52±28.54模型對照組71 521.46±194.29?312.83±37.57?241.14±53.15?鱉甲生血丸低劑量組9935.51±153.90△206.13±29.50△165.71±23.73△鱉甲生血丸中劑量組10836.72±114.81△218.52±49.62△176.26±27.65△鱉甲生血丸高劑量組10815.68±134.05△202.84±36.51△179.95±22.57△肝復康丸組9864.61±68.89△228.16±37.27△173.84±23.80△

與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05

2.4 各組大鼠灌胃5周后肝細胞損傷分級比較 見表3。

表3 各組大鼠灌胃5周后肝細胞損傷分級比較 只

表3數據經Ridit分析顯示，模型對照組灌胃5周后肝細胞損傷分級情況與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，模型對照組肝細胞損傷程度重于正常對照組。鱉甲生血丸低、中、高劑量組及肝復康丸組大鼠灌胃5周后肝細胞損傷分級情況與模型對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，各組肝細胞損傷程度均輕于模型對照組，但各組組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.5 各組大鼠灌胃5周后肝纖維化分級比較 見表4。

表4數據經Ridit分析顯示，模型對照組灌胃5周后肝纖維化分級情況與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，模型對照組肝纖維化程度重于正常對照組。鱉甲生血丸低、中、高劑量組及肝復康丸組大鼠灌胃5周后肝纖維化分級情況與模型對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，各組肝纖維化程度均輕于模型對照組，且鱉甲生血丸中、高劑量組及肝復康丸組與鱉甲生血丸低劑量組組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，肝纖維化程度均輕于鱉甲生血丸低劑量組，但鱉甲生血丸中、高劑量組及肝復康丸組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠灌胃5周后肝纖維化分級比較 只

2.6 各組大鼠肝組織病理學觀察情況 正常對照組大鼠肝小葉結構正常，肝組織無纖維組織增生；模型對照組肝小葉結構被破壞，甚至消失，肝細胞索排列不整齊，肝細胞腫脹、變性、炎性細胞浸潤，甚至伴不同程度肝細胞壞死，肝臟纖維組織明顯增生，其中5只大鼠出現肝硬化，2只大鼠多數纖維間隔形成，但沒有硬化結節；與模型對照組對比，鱉甲生血丸低、中、高劑量組及肝復康組大鼠的肝小葉結構被破壞程度明顯減輕，肝細胞腫脹、變性、壞死程度明顯減輕，但鱉甲生血丸低劑量組仍有2只大鼠出現肝硬化，5只大鼠表現為多數纖維間隔形成，但沒有硬化結節，而鱉甲生血丸中、高劑量組及肝復康組大鼠主要表現為匯管區纖維性擴大，但沒有纖維間隔形成或少數纖維間隔形成。見插頁1，圖1。

3 討 論

骨髓纖維化是由于促進纖維化的細胞生長因子過度釋放，刺激骨髓間質成纖維細胞異常激活，導致纖維化的過程，因此亦被稱為骨髓間質纖維化[12]。骨髓中異常克隆性增殖的造血干細胞逐漸取代了正常的造血組織，引起一系或者多系的造血細胞增多，尤其是功能異常的巨核細胞產生的細胞因子風暴，大量的PDGF、TGF-β1、成纖維細胞生長因子(FGF)等細胞因子引起反應性的、多克隆的纖維組織異常增生，進而使膠原形成過多，導致骨髓纖維化[13-15]。PDGF是由單核-巨噬細胞產生的，是一種重要的促細胞分裂劑，尤其對纖維母細胞有很強的促分裂作用，能分泌膠原蛋白，促進Ⅲ型膠原合成。研究表明，血小板衍生生長因子受體(PDGFR)亞單位在骨髓實質中的表達具有差異，PDGFRα在正常骨髓的巨核細胞、內皮細胞中有表達，而PDGFRβ基本很少表達，但在骨髓纖維化患者中，PDGFRβ卻強烈表達，PDGFRα只有少量的表達，并認為PDGFRβ表達隨著骨髓纖維化程度的增加而相對增加,其表達發生早于成纖維細胞和膠原纖維的形成，在骨髓纖維化前期的診斷中具有重要意義，PDGF可能在骨髓纖維化的發病機制中發揮重要作用[16-17]。TGF-β1對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調節作用，影響細胞外基質組成和下游相關酶的合成，參與了所有器官纖維化的過程，TGF-β1濃度與纖維化嚴重程度有密切關系。研究表明，在酸性環境中TGF-β1被蛋白酶激活后可以促進膠原蛋白、纖維連接蛋白及糖蛋白的合成，減少膠原酶樣蛋白酶合成，提高蛋白酶抑制物表達，抑制多種抗氧化酶表達，導致氧活性物質生成增加、調節紊亂，促進纖維化的發生[18-19]。肌成纖維細胞是組織纖維化過程中產生膠原的主要細胞類型，TGF-β1還可通過Smad信號通路促進巨噬細胞轉變成肌成纖維細胞，誘導Ⅰ型和Ⅲ型膠原轉錄，參與肝纖維化的發生，是促進肝星狀細胞活化和細胞外基質增殖的主要細胞生長因子，在肝纖維化的形成中發揮了重要的作用[20-21]。內皮細胞和成纖維細胞是造血微環境的重要組成部分，這些細胞的生長和功能受多種細胞因子的控制。VEGF是直接作用于血管內皮細胞的生長因子,可特異性促進內皮細胞增殖、分裂和遷移,增加血管通透性,促進血管生成。有研究發現，骨髓纖維化患者骨髓組織中的微血管密度明顯增加，可能與骨髓纖維組織增生有關[22]。另有研究認為，VEGF表達水平增高可引起TGF-β1mRNA的表達增強，使得TGF-β1分泌增多，活性增強，從而促進纖維化[23]。

中醫學中并無骨髓纖維化的病名，但根據其貧血、脾大、或伴肝大、骨髓纖維組織增生等臨床特征，可將其歸屬于髓毒微癥病范疇，血瘀是其主要病機[24]。隋·巢元方《諸病源候論》指出：“瘀血在內,則時時體熱而面黃,瘀久不消,則變成積聚癥瘕也。”東漢·張仲景在《金匱要略》言:“五勞虛極羸瘦,腹滿不能飲食。食傷、憂傷、飲傷、房室傷、饑傷、勞傷,經絡榮衛氣傷,內有干血,肌膚甲錯,兩目黯黑。”明·王肯堂《證治準繩》言:“瘀血成塊，堅而不移，名曰血癥。”清·王清任在《醫林改錯》中提到：“腸胃之外,無論何處,皆有氣血。氣有氣管,血有血管。氣無形不能結塊,結塊者,必有形之血也,血受寒,則凝結成塊;血受熱,則煎熬成塊。”中醫學認為，肺朝百脈，心主血脈，肝藏血，脾胃為氣血生化之源，諸臟失常，皆可致瘀血內阻。我們結合古典醫籍記載及現代醫學研究成果，認為骨髓纖維化主要是由于先天稟賦不足，后天外感邪毒，或勞倦過度，或七情內傷，或飲食失常，或藥物失治誤治，引起臟腑陰陽失調，氣血化生不足，瘀血不去，新血不生，阻滯經絡而發病，脾大即血瘀，貧血即血虛，故為虛實夾雜證。根據“虛則補之，實則瀉之”的治療原則，應以祛瘀生新為治則。鱉甲生血丸是我們根據多年臨床經驗總結出來的經驗方，先前的研究表明其對骨髓纖維化治療的總有效率為71.67%，治療后患者臨床癥狀明顯改善，骨髓活檢顯示纖維化程度均有不同程度的減輕[6]。方中鱉甲滋陰潛陽，軟堅散結；熟大黃逐瘀通經，瀉熱解毒，與鱉甲配伍可增強其活血化瘀功效；炒桃仁活血化瘀；三棱、水蛭，破血行氣，逐瘀消積；熟地黃、紫河車補氣養血，并防大黃、三棱過度攻伐之弊；三七止血補血而不留瘀；甘草益氣解毒，調和諸藥。諸藥合用，共奏活血化瘀、軟堅散結、祛瘀生新的功效。

Hyp是亞氨基酸之一，人體蛋白質中以膠原蛋白Hyp水平含量最多，約占膠原蛋白氨基酸總量的13%，除彈性蛋白含極少量Hyp外，其他均不含Hyp，通過測定肝臟組織的Hyp含量，可反映肝臟纖維化程度。肝復康丸為臨床治療急慢性肝炎、肝硬化、肝功能不良等疾病的常用藥物，具有收斂、益氣、解毒的功效，在一定程度上可以修復受損的肝細胞，改善肝功能，對肝纖維化的治療具有確切療效[25]，因此我們選用了肝復康丸作為對照觀察治療。本實驗研究結果顯示，灌胃5周后鱉甲生血丸中、高劑量組及肝復康丸組大鼠肝組織Hyp含量均低于模型對照組(P<0.05)，鱉甲生血丸低、中、高劑量組及肝復康丸組大鼠血清PDGF、TGF-β1及VEGF水平均低于模型對照組(P<0.05)，鱉甲生血丸低、中、高劑量組及肝復康丸組大鼠肝細胞損傷分級情況及肝纖維化分級情況均輕于模型對照組(P<0.05)，且鱉甲生血丸中、高劑量組與肝復康丸組大鼠各指標組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。提示鱉甲生血丸可明顯抑制纖維組織增生，減少組織內膠原的形成和沉積，且中、高劑量組效果更好，其治療骨髓纖維化的作用機制可能與降低Hyp、TGF-β1、PDGF及VEGF水平有關。