前列腺癌組織miR-802、RAB23表達變化及其與患者臨床病理特征和預后的關系

胡爭，李先林，瞿曦，馬進華，張志蓓

1 湖北省第三人民醫院，武漢430000；2 湖北省榮軍醫院

前列腺癌是中老年男性泌尿生殖系統常見的惡性腫瘤之一。中國癌癥統計數據顯示，2015年前列腺癌的預期發病率和病死率分別為6.03/10萬例、2.66/10萬例[1，2]。前列腺癌早期常無明顯癥狀，大多數患者發現時已處于中晚期。內分泌治療是進展期前列腺癌首選的治療方式。但對于晚期轉移性前列腺癌或去勢抵抗前列腺癌，內分泌治療效果較差[3]。目前，前列腺癌發病的確切分子機制尚不清楚。因此，深入研究與前列腺癌發生、發展相關的分子，對其早期診斷和靶向治療具有重要意義。微小RNA(miRNA)是真核細胞中的一類內源性非編碼RNA，長度18～25個核苷酸，雖然不具備編碼蛋白質的功能，但可與靶基因mRNA的3′非翻譯區結合，通過改變mRNA的穩定性，調控下游靶基因表達。近年研究發現，在惡性腫瘤中存在多種miRNA異常表達現象，其異常表達與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等生物學行為密切相關[4]。miR-802是miRNA家族成員之一，定位于人染色體21q22.12。有研究發現，乳腺癌細胞miR-802表達降低，上調miR-802表達可通過抑制FoxM1表達發揮抗腫瘤作用[5，6]。RAB23是RAS原癌基因成員，定位于人染色體6p12.1。RAB23的編碼產物為RAS超家族的小GTP結合蛋白，能夠參與細胞內膜運輸，包括自噬和細菌感染免疫反應相關多種細胞功能的調節。有研究發現，RAB23高表達能夠促進腫瘤細胞的浸潤和遷移能力[7]。有研究還發現，RAB23是miR-802的生物學靶點，miR-802能夠在轉錄后水平抑制RAB23表達，從而促進胃癌的惡性進展[8]。但目前二者表達變化與前列腺癌發生、發展的關系尚不清楚。為此，本研究觀察了前列腺癌組織miR-802、RAB23表達變化，并探討其在前列腺癌發生、發展中的作用。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月～2016年1月湖北省第三人民醫院收治的前列腺癌患者80例。所有患者經術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合前列腺癌診斷，病理類型為腺癌；②初診；③接受前列腺癌根治術或腫瘤細胞減滅術；④既往未接受任何抗腫瘤治療；⑤臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標準：①非前列腺腺癌者；②合并泌尿生殖系統、呼吸系統等感染性疾病者；③合并其他器官或系統惡性腫瘤者；④合并心、肝、肺、腎等重要臟器嚴重功能不全者。患者年齡42～78(55.24±7.1)歲，其中≤65歲31歲、>65歲49例；Gleason評分：<7分36例，≥7分44例；組織分化程度：高中分化39例，低未分化41例；初始前列腺特異性抗原(PSA)水平：≤10 ng/mL 24例，>10 ng/mL 56例；臨床分期[9]：Ⅰ、Ⅱ期58例，Ⅲ、Ⅳ期22例；有遠處轉移16例，無遠處轉移64例。本研究經湖北省第三人民醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 miR-802、RAB23表達檢測 采用RT-qPCR技術。收集術中切除的前列腺癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣>1 cm并經組織病理檢查證實為正常前列腺組織)，置于凍存管中，液氮轉運至-80 ℃冰箱保存，待組織成批。取前列腺癌組織與癌旁正常組織各約100 mg，采用TRIzol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續實驗。按TaqMan miRNA反轉錄試劑盒說明將總RNA反轉錄為cDNA。反轉錄條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，分別按SYBR Premix Ex Taq試劑盒和mirVanaTMmiRNA分離試劑盒說明進行PCR擴增。所有引物由上海吉凱基因化學技術有限公司設計合成。引物序列：miR-802上游引物5′-GGACCACCGCTCGCTCATCGCTAA-3′、下游引物5′-TCGCGTTACTATATGCCAAGCCCTAG-3′，內參U6上游引物5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′、下游引物3′-GTGCAGGGTCCGAGGT-5′；RAB23上游引物5′-GGGGTACCCCAGATGTTTTGGGAGGAAAAC-3′、下游引物5′-GAAGATCTTCATCTAAAATGGCAAAGAGAA-3′，內參GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′、下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。miR-802 PCR反應體系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，DEPC水7 μL；反應條件：95 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 15 s、70 ℃ 30 s共40個循環。RAB23 PCR反應體系共20 μL：cDNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶0.125 μL，上下游引物各1 μL，20×SYBR Green 1 μL，25 mmol/L dNTPs 1 μL，DEPC水補足至20 μL；反應條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者自出院后采用門診、電話等形式隨訪，1～3個月隨訪1次，隨訪截至2019年1月，終點事件為患者死亡，統計患者生存情況，計算3年總體生存率。

2 結果

2.1 前列腺癌組織與癌旁正常組織miR-802、RAB23表達比較 前列腺癌組織與癌旁正常組織miR-802相對表達量分別為1.230±0.246、1.731±0.215，RAB23相對表達量分別為1.041±0.210、0.467±0.118。前列腺癌組織miR-802相對表達量低于癌旁正常組織，RAB23相對表達量高于癌旁正常組織(t分別為13.716、21.313，P均<0.05)。

2.2 前列腺癌組織miR-802表達與RAB23表達的關系 Pearson線性相關分析顯示，前列腺癌組織miR-802相對表達量與RAB23相對表達量呈負相關關系(r=-0.626，P<0.05)。

2.3 前列腺癌組織miR-802、RAB23表達與患者臨床病理特征的關系 見表1。

表1 前列腺癌組織miR-802、RAB23表達與患者臨床病理特征的關系

2.4 不同miR-802、RAB23表達與前列腺癌患者預后的關系 截至隨訪日期，共隨訪3～48個月、中位隨訪時間32個月，隨訪期間死亡46例，無失訪。

以前列腺癌組織miR-802相對表達量的均數1.226為臨界值，將患者分為miR-802高表達者38例、低表達者42例。miR-802高表達者3年總體生存率為65.8%(25/38)，miR-802低表達者為50.0%(21/42)。miR-802高表達者3年總體生存率與miR-802低表達者比較差異無統計學意義(χ2=3.214，P>0.05)。

以前列腺癌組織RAB23相對表達量的均數1.045為臨界值，將患者分為RAB23高表達者44例、低表達者36例。RAB23高表達者3年總體生存率為36.4%(19/44)，RAB23低表達者為75.0%(27/36)。RAB23高表達者3年總體生存率低于RAB23低表達者(χ2=4.861，P<0.05)。

3 討論

前列腺癌是中老年男性泌尿生殖系統常見的惡性腫瘤之一。近年來前列腺癌的發病率不斷升高，已成為威脅男性健康的第二大惡性腫瘤。前列腺癌早期通過根治性手術或根治性放療等手段，可達到較好的治療效果，甚至治愈[10]。由于前列腺癌早期常無明顯癥狀，大多數患者發現時已處于中晚期，內分泌治療成為其首選的治療方式。但對于晚期轉移性前列腺癌或去勢抵抗前列腺癌，內分泌治療效果較差[3]。因此，深入探索與前列腺癌發生、發展相關的分子，對其早期診斷和靶向治療具有重要意義。

miRNA是一種內源性單鏈小分子RNA，主要參與基因轉錄后調控，在多細胞生物的發育過程中發揮重要作用。研究證實，在肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤中存在miRNA異常表達現象，通過檢測組織或血清miRNA表達有助于腫瘤的早期診斷[11]。miR-802是miRNA家族成員之一，定位于人染色體21q22.12。miR-802可參與構成RNA誘導的沉默復合物(RISC)，而RISC能夠通過不完全堿基配對的方式識別靶mRNA，導致靶mRNA的翻譯抑制或去穩定化[12]。研究表明，miR-802在舌鱗癌、肝癌等惡性腫瘤中存在表達下調現象，其異常表達可引起其靶基因MAP2K4表達升高，從而導致腫瘤惡性進展[13]。RAB23是RAS原癌基因成員，定位于人染色體6p12.1。RAB23的編碼產物為RAS超家族的小GTP結合蛋白，通過促進囊泡運輸和控制溶酶體內吞等參與細胞內膜運輸。有研究報道，RAB23可通過整合素β1/Rac1信號途徑促進鱗癌細胞侵襲和遷移[7]。有研究還發現，RAB23是miR-802的生物學靶點，miR-802能夠在轉錄后水平抑制RAB23表達，從而促進胃癌的惡性進展[8]。但目前二者表達變化與前列腺癌發生、發展的關系尚不清楚。

本研究結果發現，前列腺癌組織miR-802相對表達量低于癌旁正常組織，其表達下調一方面可能與miR-802基因位點的雜合性缺失有關，一方面可能與miR-802基因的甲基化、乙酰化等表觀遺傳學修飾有關[14]。本研究結果顯示，前列腺癌組織miR-802相對表達量與Gleason評分、臨床分期有關，而與年齡、初始PSA水平、組織分化程度和遠處轉移無關，提示miR-802有可能參與前列腺癌的惡性進展，其機制可能與miR-802對靶基因Flotillin-2抑制作用降低，導致Flotillin-2表達增加，進而促進腫瘤細胞上皮間質轉化，最終導致腫瘤惡性進展[15]。本研究進一步分析了不同miR-802表達與前列腺癌患者預后的關系，結果發現miR-802高表達者3年總體生存率與miR-802低表達者比較差異無統計學意義，表明miR-802并非影響前列腺癌患者預后的關鍵因素。這可能與本研究隨訪時間較短有關。此外，腫瘤的發生、發展過程中存在多種miRNA異常表達現象，一種癌基因可同時受多種miRNA調控，而同一種miRNA亦能調控多種靶基因，從而形成復雜的miRNA調控網絡[16]。

RAB23是Hedgehog信號途徑重要的負性調節因子。RAB23表達增加可誘導細胞G1期阻滯，從而導致腫瘤細胞凋亡減少。RAB23表達還能促進Gli1、Gli2表達，從而促進腫瘤細胞增殖[17]。有研究表明，RAB23在肝癌、胃癌等惡性腫瘤細胞中表達升高，沉默RAB23表達后腫瘤細胞的侵襲和遷移能力明顯下降[18]。有學者通過TargetScan對miR-802的靶點進行預測，結果發現RAB23是miR-802潛在的作用靶點，進一步通過熒光素酶報告基因實驗驗證RAB23是miR-802的直接作用靶基因，通過siRNA技術敲除miR-802表達后，RAB23表達降低[8]。本研究結果發現，前列腺癌組織RAB23相對表達量高于癌旁正常組織；相關分析發現，前列腺癌組織RAB23相對表達量與miR-802相對表達量呈負相關關系。提示miR-802表達下降能夠通過促進RAB23表達增加，從而促進前列腺癌的發生、發展。本研究結果發現，前列腺癌組織RAB23相對表達量與Gleason評分、臨床分期有關，而與年齡、初始PSA水平、組織分化程度和遠處轉移無關。提示RAB23可能參與前列腺癌的惡性進展，其機制可能是RAB23對Hedgehog信號途徑的抑制作用減弱，從而促進腫瘤的局部浸潤和遠處轉移。此外，RAB23還可直接促進轉移相關因子Rac1表達，從而促進前列腺癌轉移[19]。本研究還發現，RAB23高表達者3年總體生存率低于RAB23低表達者，提示RAB23高表達與前列腺癌患者預后不良有關。因此，RAB23有可能成為評估前列腺癌患者預后的分子生物標志物。

綜上所述，前列腺癌組織miR-802低表達、RAB23高表達，二者表達變化與前列腺癌的發生、發展和患者預后有關。miR-802、RAB23有望成為前列腺癌早期診斷、靶向治療和預后評估的分子生物標志物。