胃癌組織中lncRNA-PVT1、Atg5的表達變化及臨床意義

韋斌,黃俏瑩,黃順榮，鐘曉剛，麥威，牙韓清，朱州，張貴年

1 廣西壯族自治區人民醫院，南寧 530021；2 廣西醫科大學第一附屬醫院

胃癌屬于常見的消化道惡性腫瘤，其病死率在惡性腫瘤中位居第二，而中國的胃癌病死率約占世界的43%[1]。胃癌早期無明顯癥狀，易被患者忽視，就診時絕大多數患者病情已進展到中晚期，預后較差，5年生存率僅為10%[2]。既往研究[3]表明，早期診斷胃癌可以使患者的5年生存率達到80%～90%。因此，掌握胃癌病變的調控機制進行早期診斷和靶點治療對延長患者生存時間意義重大。長鏈非編碼RNA(LncRNA)盡管不能編碼蛋白質，但可以調節基因表達，參與染色質修飾，調控蛋白質活性，且在時間、空間以及組織上均具有特異性[4]。長鏈非編碼RNA-漿細胞瘤變體易位1(LncRNA PVT1)是LncRNA的一種類型，在正常組織中低度表達，然而在轉化細胞系的表達明顯提高，在癌細胞增殖、侵襲以及轉移中具有促進作用[5～7]。研究[8]發現，自噬過程的異常激活會破壞機體內的細胞器及蛋白質，為腫瘤細胞增殖和浸潤提供條件，自噬相關基因5(Atg5)的異常表達是自噬過程異常激活的關鍵因素。此外，異常表達的Atg5能夠影響細胞內新陳代謝及凋亡速率，使細胞內環境紊亂，是惡性腫瘤形成和發展的關鍵步驟。LncRNA PVT1和Atg5是否共同參與癌變進展需臨床進一步研究[6]。本研究將探討LncRNA PVT1和Atg5在胃癌組織及其癌旁正常組織的表達差異，并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析廣西壯族自治區人民醫院于2016年1月～2019年2月收治的103例胃癌患者的臨床及病理資料。納入標準：所有患者符合《中國常見惡性腫瘤診治規范》[9]且經術后病理確診為胃腺癌；既往無胃部手術史或放化療史；基本資料完整。排除標準：合并其他惡性腫瘤者；合并胃部其他嚴重疾病，如胃穿孔、慢性萎縮性胃炎以及胃間質瘤等；肝腎功能明顯異常者；存在自身免疫性疾病或免疫系統異常。其中男59例、女44例，年齡≥60歲54例、<60歲49例，有淋巴結轉移者24例、無淋巴結轉移者79例，低分化者9例、中分化者51例、高分化者43例，TNM分期Ⅰ期42例、Ⅱ期35例、Ⅲ期20例、Ⅳ期6例，腫瘤直徑≤5 cm者61例、>5 cm者42例。所有患者接受胃癌根治術治療。術中切取胃癌組織及其對應癌旁5 cm以上正常組織，將其放入液氮中暫時保存，術后統一保存于-80 ℃冰箱中。本研究獲得醫院倫理委員會批準，且參與研究患者均簽署知情同意書。

1.2 LncRNA PVT1、Atg5檢測方法 應用實時熒光定量PCR技術。各取胃癌組織及其癌旁正常組織50 mg，均加入1 mL的TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，根據其操作步驟提取總RNA。用2.0 μg總RNA合成cDNA，通過PrimeScript 1st strand cDNA合成試劑盒完成操作。LncRNA PVT1和Atg5定量表達選用凱杰公司SYBR?Green PCR Kit試劑盒進行檢測，嚴格遵守說明書完成操作。LncRNA PVT1的引物合成條件為42 ℃ 1 h、70 ℃ 5 min，正向引物為5′-CAACCAGGACCGGGTCAAACG-3′，反向引物為5′-GCCTCGGACATGACCTTCCACT-3′，其長度為92 bp，退火溫度控制在59 ℃。內參基因β-actin的正向引物為5′-CCCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT-3′，反向引物為5′-ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCG-3′，其長度為101 bp，退火溫度控制在55 ℃。PCR反應條件：預變性在95 ℃時維持5 min，變性在95 ℃時維持10 s，退火及延伸在55 ℃維持30 s。Atg5的引物合成條件為37 ℃ 1 h、95 ℃ 5 min，正向引物為5′-GCCATCAATCGGAAACTCAT-3′，反向引物為5′-CAGCCACAGGACGAAACAG-3′。內參基因U6的正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應條件為預變性95 ℃ 15 min，變性94 ℃ 15 s，退火55 ℃ 30 s，延伸70 ℃ 30 s。以上所有引物由上海生工生物工程有限公司負責合成，反應均為40個循環，每個樣本均進行3次檢測。采用2-ΔΔCt法計算LncRNA PVT1、Atg5相對表達量。

2 結果

2.1 胃癌組織及其癌旁正常組織中LncRNA PVT1和Atg5表達比較 胃癌組織及其癌旁正常組織中LncRNA PVT1相對表達量分別為6.27±1.43、1.34±0.21，Atg5相對表達量分別為2.31±0.34、1.05±0.14，胃癌組織中LncRNA PVT1、Atg5相對表達量均較癌旁正常組織高(P均<0.01)。

2.2 胃癌組織中LncRNA PVT1、Atg5表達與患者臨床病理參數的關系 見表1。

表1 胃癌組織中LncRNA PVT1、Atg5表達與患者臨床病理參數的關系

2.3 胃癌組織中LncRNA PVT1與Atg5表達的相關性 胃癌組織中LncRNA PVT1的表達和Atg5的表達呈正相關(r=0.553，P=0.000)。

3 討論

胃癌的發生與飲食習慣、環境因素、基因突變及調控密切相關[10]，具體機制極為復雜，目前仍缺乏便捷有效的早期診斷指標，因此多數患者確診時胃癌已進展到中晚期。隨著基因測序技術的不斷成熟，近年來眾多研究[11,12]表明，某些基因失調能夠增加胃癌易感性，如LncRNA、微小RNA以及c-myc等，這些基因在細胞分化、增殖以及凋亡的調節中起關鍵作用。非編碼RNA含量約占基因組整體的98%，盡管不能編碼蛋白質，但能夠調控mRNA拼接及基因轉錄，對多種疾病的發生起重要作用。LncRNA在非編碼RNA中含量最多，具有修飾染色質、干擾細胞質中核糖核酸穩定性以及調節微小RNA活性的作用。LncRNA對細胞周期和細胞侵襲及轉移均具有重要影響，且參與調控多種腫瘤信號通路，如mTOR、Wnt、Notch以及NF-κB等[13]。由于LncRNA檢測具有價格實惠、可重復以及操作簡便等優勢，目前DD3PCA3、MALAT-1以及HOTAIR等多種LncRNA已被作為早期診斷和評估預后的標志物。LncRNA PVT1位于染色體8q24.21，處于c-myc上游，其內包含6種微小RNA。LncRNA PVT1通過促進細胞周期蛋白依賴性激酶4的表達，使原癌基因c-myc表達上調，進而導致腫瘤細胞無限增殖[14]。既往研究[7]表明，發生惡性腫瘤(直腸癌、非小細胞肺癌等)時LncRNA PVT1常出現異常擴增及拷貝數增加。本研究結果顯示，胃癌組織中的LncRNA LncRNA PVT1相對表達量較癌旁正常組織提高，與Kong等[15]研究結果一致。分析原因可能為,胃癌組織中的癌細胞刺激巨噬細胞和淋巴細胞分泌大量的細胞因子(如IL-6)，經信號轉導通路傳遞后使LncRNA PVT1表達上調[16]。本研究結果表明，胃癌組織中LncRNA PVT1的表達與淋巴結轉移和TNM分期有關，表明LncRNA PVT1可以促進胃癌發展，反映胃癌的TNM分期及有無淋巴結轉移，間接評估患者病情。其機制可能為LncRNA PVT1能夠激活Zeste同系物2(Ezh2)，而Ezh2已被證實為癌基因，其表達上調可以誘導p15和p16調控系統活化，促進癌細胞增殖及分化，最終導致癌癥進展惡化[17]。此外，LncRNA PVT1能夠抑制PDCD4蛋白轉錄，從而阻礙正常細胞基因轉錄后發揮生物功能，同時，PDCD4蛋白表達降低后會導致對金屬蛋白酶9抑制作用減弱，從而促進癌細胞的增殖及侵襲[16]。

自噬是一種通過溶酶體降解細胞器及膜蛋白質的細胞程序性死亡，對機體具有一定的保護作用[18]。然而，異常激活自噬過程可以破壞機體內正常的細胞器及蛋白質，為腫瘤細胞增殖和浸潤提供條件。Atg5位于染色體6q21上，通過共價結合Atg12對自噬過程的延伸階段具有重要調控作用。據相關研究[19]報道，Atg5的突變或異常表達可以損傷DNA并降低基因組的穩定性，進而增加腫瘤發生風險。本研究結果顯示，胃癌組織中Atg5相對表達量較癌旁正常組織高，Atg5的表達與分化程度和TNM分期有關。表明Atg5可以評估胃癌的分化程度及判斷胃癌分期。其原因可能為胃癌組織內表達上調的泛素特異肽酶22(USP22)通過使沉默信息調節因子(sirt1)去泛素化，進而穩定sirt1表達，而sirt1能夠促進Atg5和Atg7去乙酰化，進而誘導異常自噬，損傷細胞內的DNA及蛋白質，增強了癌細胞的侵襲能力[20]。此外，Atg5通過與泛素化的Atg7和Atg10共價結合，從而激活自噬過程，促進癌細胞內大量生成ATP并激活線粒體內的β-氧化，使癌細胞營養代謝活躍，加速其分裂及分化，促進癌細胞侵襲及遷移[19]。

本研究表明，胃癌組織中LncRNA PVT1的表達與Atg5的表達呈正相關。表明LncRNA PVT1和Atg5可能具有協同作用，二者共同誘導胃癌的形成和進展。其機制可能是胃癌組中的LncRNA PVT1能夠直接結合Atg5，誘導Atg5表達。既往研究[21]報道，LncRNA PVT1過表達時能夠使Atg5上調，而抑制LncRNA PVT1時則Atg5下調。然而由于本研究樣本數量及實驗設施的限制，LncRNA PVT1和Atg5互相調控的具體機制尚不明確，需要進一步探究。

綜上所述，LncRNA PVT1和Atg5在胃癌組織中均高表達，二者相互作用共同影響胃癌的發生和進展，可能成為胃癌早期診斷和藥物靶點治療的標志物。