miR-613在肝細胞癌中的表達變化及其對癌細胞增殖、凋亡及侵襲、遷移能力的影響

曾保征，王贛，陳超，黃遠麗，董超

1麻城市人民醫院，湖北麻城 438300；2華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院

肝細胞癌(HCC)是一種常見的肝臟原發惡性腫瘤，具有較高的發病率和致死率，患者的5年生存率低于12%[1]。HCC的發生與酒精性肝硬化、病毒性肝炎等有關，其發生、發展及遷移、侵襲與基因、蛋白、細胞因子等許多因素有關。miRNA是近年來發現的小分子短鏈非編碼RNA，廣泛參與細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學過程。近期國內外研究表明，miR-613在宮頸癌[2]、胃癌[3]、卵巢癌[4]、非小細胞肺癌[5]等多種惡性腫瘤中表達異常，與惡性腫瘤的發生發展密切相關。但目前國內外有關miR-613在HCC中表達變化的研究甚少，并且作用機制尚不明確。因此，本研究觀察了HCC組織中miR-613的表達情況，并探討了miR-613過表達對HCC細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年7月～2018年6月在麻城市人民醫院治療的60例HCC患者，所有患者診斷均經病理學檢查證實，手術前均未進行放療或化療等治療。選取手術切除腫瘤組織為HCC組織，同時選取離腫瘤組織邊緣5 cm以外的癌旁組織作為對照。60例患者中男44例、女16例，年齡(56.75±12.86)歲。根據國際抗癌聯盟(UICC)肝癌TNM分期標準[6]對HCC患者進行臨床分期，其中Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期41例。根據Edmondson標準[7]對患者進行病理分級，其中Ⅰ級19例，Ⅱ～Ⅲ級19例，Ⅳ級22例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 細胞來源及培養 人HCC細胞系MHCC97H、SMMC-7721和人正常肝細胞系L02購自中國科學院上海細胞庫，采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液進行培養，在溫度為37 ℃、5% CO2、飽和濕度的情況下進行細胞傳代培養。

1.3 miR-613檢測 采用miRNA分離純化試劑盒(美國Ambion公司)提取肝癌組織、癌旁組織標本及細胞的總miRNA，采用TaqMan miRNA反轉錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)對總miRNA進行反轉錄生成cDNA。取cDNA，按照TaqMan miRNA檢測試劑盒說明書檢測miR-613的表達水平。引物由美國GeneCopoeia公司設計合成。引物序列如下：miR-613引物上游為5′-ACACTCCAGCTGGGATGGAATGTTCCTTC-3′,下游為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGAAACGG-3′；U6引物上游為5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應條件為10 min 95 ℃，10 s 95 ℃，20 s 60 ℃，15 s 72 ℃，共40個循環。以U6作為內參照，以2-ΔΔCt法計算miR-613的相對表達量。

1.4 細胞轉染 將SMMC-7721細胞接種于6孔板中，細胞分為miR-613 mimics組和mimics-NC組，在細胞處于對數生長期時分別將購自上海吉瑪制藥公司的miR-613模擬物(miR-613 mimics)或模擬物陰性對照(mimics-NC)轉入各組SMMC-7721細胞，6 h換1次培養液，共培養24～48 h，收集細胞進行后續實驗。采用實時熒光定量PCR技術檢測miR-613的表達，驗證轉染效率。

1.5 細胞增殖情況觀察 采用MTT實驗。將miR-613 mimics組、mimics-NC組細胞接種于96孔板，每孔接種細胞數為1×104個，每組設3個復孔，轉染成功后24、48、72 h每孔加入10 μL的MTT溶液(美國Sigma公司)培養4 h，再加入100 μL的溶解液，直至紫色結晶溶解，在酶標儀上測定492 nm處的光密度(OD)值。以OD值表示細胞的增殖活性。

1.6 細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞術。離心收集miR-613 mimics組、mimics-NC組轉染成功48 h后的細胞，用培養基重懸細胞使細胞懸液濃度為1×109/L。按Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司)說明書操作，取細胞懸液0.5 mL，加入1.25 μL的Annexin V-FITC在室溫下進行15 min的避光反應，離心收集細胞，采用預冷的1×結合緩沖液0.5 mL輕輕重懸，加入10 μL的碘化丙啶避光保存于冰上，采用CytoFLEX流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)檢測細胞的凋亡率。

1.7 細胞侵襲及遷移情況觀察 采用Transwell小室遷移和侵襲實驗。在Transwell小室接種前，將Matrigel(美國BD公司)預鋪小室上室。在上室接種200 μL濃度為2×105/mL的無血清培養基細胞，下室加入600 μL的含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，培養24 h后，取出Transwell小室，用4%多聚甲醛溶液對細胞進行固定，結晶紫染色后將上層細胞擦掉并用PBS洗滌。在高倍顯微鏡下計數穿過小室膜的細胞數并取平均值，即為侵襲穿膜細胞數，實驗重復3次，取平均值。遷移實驗時，不用Matrigel預鋪小室上室，其余步驟同侵襲實驗。

2 結果

2.1 miR-613在HCC組織中的表達及其與臨床病理參數的關系 miR-613在HCC組織的表達為0.32±0.11，較癌旁組織(0.98±0.04)表達降低(t=43.678，P<0.05)。以miR-613表達的均值為截斷點，分為高表達(23例)和低表達(37例)。miR-613表達與HCC患者臨床病理參數的關系見表1。

2.2 miR-613在人肝細胞系中的表達 miR-613在人HCC細胞系MHCC97H和SMMC-7721的相對表達量分別為0.52±0.13、0.21±0.09，均較人正常肝細胞系L02(1.05±0.11)表達降低(t=5.391、10.237，P均<0.05)。選擇miR-613表達最低的SMMC-7721細胞作為后續研究對象。

2.3 miR-613對SMMC-7721細胞增殖活性的影響 轉染后，miR-613 mimics組miR-613相對表達量為5.47±0.34，較mimics-NC組(0.99±0.06)升高(t=22.475，P<0.05)，提示轉染效率較高。miR-613對SMMC-7721細胞增殖的影響見表2。

表1 miR-613表達與HCC患者臨床病理參數的關系[例(%)]

表2 miR-613對SMMC-7721細胞增殖的影響

注：與mimics-NC組相比，*P<0.05。

2.4 miR-613對SMMC-7721細胞凋亡的影響 miR-613 mimics組細胞凋亡率為(26.48±4.14)%，較mimics-NC組[(5.98±1.75)%]升高(t=7.900，P<0.05)。

2.5 miR-613對SMMC-7721細胞遷移及侵襲的影響 miR-613 mimics組、mimics-NC組遷移細胞數分別為(160±22)、(342±34)個，侵襲細胞數分別為(105±19)、(279±23)個，兩組相比P均<0.05。

3 討論

HCC早期癥狀較為隱匿，70%～80%的患者發現時已為晚期，診斷后患者的平均生存時間為6個月，沒有治療的患者5年生存率小于3%[8]。隨著醫療技術的發展，HCC的病死率有所下降，但HCC的復發率較高，患者預后仍然很差。隨著蛋白質組和基因組學研究的發展，近期研究發現miRNA在不同腫瘤中表達模式不同，并且與惡性腫瘤的發生發展密切相關，為惡性腫瘤的靶向治療提供了新的思路。

miR-613是一種近期發現的存在人體內的miRNA家族成員之一，其定位于人染色體12p13.1，含有20個核苷酸。miR-613在多種腫瘤組織或細胞中呈低表達，具有調控腫瘤細胞增殖和轉移的作用。李傳芬等[9]研究表明miR-613在膠質瘤組織中呈低表達，且miR-613可抑制膠質瘤細胞的生長、遷移和侵襲。張東兵等[10]的研究表明，上調miR-613可抑制甲狀腺乳頭狀癌的增殖和遷移及侵襲。Yu等[11]研究表明miR-613在膀胱癌組織和細胞中呈低表達，可抑制膀胱癌細胞的增殖和侵襲。上述文獻研究表明，miR-613在腫瘤的發生發展中可能起著抑癌基因的作用。本研究發現miR-613在HCC組織的表達明顯低于癌旁組織，在人肝癌細胞系中表達低于正常肝細胞系，與上述其他惡性腫瘤中的研究結果一致。本研究進一步統計分析表明,TNM分期越晚，miR-613表達越低；Edmondson分級越高，miR-613表達越低，提示miR-613與HCC的發生進展有關，對HCC的分期和病理分級具有潛在的預測價值。

研究發現，恢復腫瘤細胞內異常表達的miRNA水平可以有效抑制惡性腫瘤的發展，因此可能成為一種有效的分子靶向治療方式。本研究發現，上調miR-613后SMMC-7721細胞增殖活性明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，侵襲和遷移實驗中穿過小室膜的細胞數均明顯減少，結果表明過表達miR-613能夠抑制HCC細胞增殖、遷移和侵襲，同時促進細胞凋亡。文獻研究表明，在腎細胞癌中，miR-613通過靶向CTTN而調控細胞的增殖和遷移[12]。Wang等[13]發現，在非小細胞肺癌中，miR-613通過靶向調節雙皮質素激酶樣結構域1而致使細胞周期停滯。Wu等[14]發現，在乳腺癌中miR-613通過靶向血管內皮生長因子A而抑制細胞的增殖和侵襲。miR-613在HCC中作用的具體下游靶基因，尚需在進一步的研究中預測并驗證。

綜上所述，miR-613在HCC中呈低表達，過表達miR-613能夠抑制HCC細胞增殖、遷移和侵襲，同時促進細胞凋亡，這為HCC的靶向治療提供了新的方向。