益氣活血方對心力衰竭大鼠心功能的影響及其機制

邢俊娥，吳鵬，李海沅，張興博

廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530023

慢性心力衰竭(CHF)又稱充血性心力衰竭(簡稱心衰)，是一種中老年人常見而又復雜的臨床癥狀群，是各種心血管疾病發展的共同終末階段，病死率極高。近年來，CHF的治療已經取得很大的進展，特別是隨著血管緊張素轉換酶抑制劑、β受體阻滯劑及冠狀動脈血管重建術的應用，心衰患者的生存時間明顯延長，病死率顯著下降。然而因人口老齡化程度的日益加深，CHF的發病率逐年增加，每年CHF死亡人數并沒有減少，甚至還存在上升趨勢[1]。因此，積極探討CHF的發病機制和開發有效防治CHF的藥物仍是當今心血管疾病領域重大課題之一。Wnt/β-catenin信號通路是廣泛存在于多細胞真核生物中的一條高度保守的信號傳導通路，參與調控細胞的增殖、凋亡、遷移、分化等多種生理病理過程。近年來研究發現，Wnt/β-catenin信號通路異常激活可使細胞及生物體的功能產生障礙或損壞，比如導致心肌細胞肥大、心肌纖維化[2]，通過干預此信號通路蛋白的表達可誘導多能干細胞向心肌細胞分化，從而提高心功能、改善心衰癥狀[3,4]。這使人們逐漸認識到Wnt/β-catenin信號通路異常激活可能是心衰發生發展中的重要因素。益氣活血方以補心益氣、活血利水為法立方，前期研究表明其能減少心肌組織細胞凋亡發揮抗心衰的作用[5]。2018年5月～2019年5月，本研究通過觀察益氣活血方對心衰大鼠心肌細胞Wnt/β-catenin信號通路表達的影響，探討益氣活血方治療心衰的可能機制，為其在臨床上的應用提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 益氣活血方由廣西中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供，藥物組成：黃芪20 g、黨參30 g、赤芍15 g、川芎15 g、丹參15 g、麥冬10 g、五味子15 g、茯神15 g、炙甘草8 g，制成每毫升含生藥1.52 g的溶液。氯沙坦片(杭州默沙東制藥有限公司，批號：H20000371，規格：50 mg/片)；兔抗大鼠Dvl1抗體(Sigma-Aldrich公司)；兔抗大鼠p-GSK-3β(Ser9)抗體(Cell Signaling公司)；兔抗大鼠B-catenin抗體(Epitomics公司)。

1.1.2 動物 健康雄性SD大鼠120只，體質量(200±20)g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證編號:SYXK(桂)2013-0005。

1.1.3 儀器 JA203型精密電子天平(上海海康電子儀器廠)；TKR小動物呼吸機(江蘇特力麻醉呼吸公司)；ML870Br心電圖機(澳大利亞埃德公司)；MICRO MAXX型彩色多普勒超聲診斷儀(美國索諾聲公司)；Anke TGL-16B離心機(上海安亭科學儀器廠)；蛋白質電泳與轉膜裝置(美國Bio-Rad公司)。

1.2 CHF模型制作 將120只大鼠適應性喂養1周后隨機分為造模組100只與假手術組20只。以10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉，將其固定于手術臺，經喉行氣管插管術，連接小動物呼吸機及心電圖機，以呼吸頻率80次/min、潮氣量0.7～0.8 mL(按體質量調節)行人工輔助呼吸。左胸前區備皮去毛，絡合碘消毒，在左側第3、4肋間隙橫向切開皮膚，長約1.5 cm，鈍性分離肌層，沿第3、4肋間隙打開胸腔并用開胸器撐開，撕開心包，在動脈圓錐與左心耳之間下約1 mm處用0號絲線結扎左冠狀動脈前降支，當心電圖Ⅰ、Ⅱ導聯顯示ST段顯著抬高后，迅速將心臟放回胸腔，擠出胸腔內血液和氣體，并立即分層縫合胸壁，開胸時間不超過30 s。待動物狀態平穩后，停止呼吸機輔助呼吸。術后連續3 d腹腔注射青霉素[2.4×104U/(kg·d)]預防感染。假手術組手術過程同上，但僅在冠狀動脈前降支下穿線不結扎。然后將存活大鼠返籠繼續常規飼養4周，4周后心臟彩色超聲檢測左室射血分數<50%者為CHF模型復制成功。

1.3 動物分組與給藥 將CHF大鼠隨機分成4組：模型組、益氣活血方低劑量組、益氣活血方高劑量組和氯沙坦陽性對照組，每組10只，益氣活血方低、高劑量組及氯沙坦陽性對照組分別灌胃3.04、6.08 g/(kg·d)益氣活血方及10 g/(kg·d)氯沙坦；另選擇假手術組10只，假手術組及模型組以20 mL/kg蒸餾水灌胃，益氣活血方低劑量組、益氣活血方高劑量組和氯沙坦陽性對照組將藥物溶于等體積蒸餾水中，1次/d，療程4周。

1.4 心功能測定 藥物干預4周后，利用心臟彩色多普勒超聲診斷儀檢測心功能。具體方法如下：大鼠稱重，以1%戊巴比妥鈉(0.03 g/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，心前區脫毛，涂抹耦合劑，用心臟超聲探頭(頻率為6～13 MHz)，在二維超聲引導下，運用M型超聲經胸骨左心長軸切面測量如下指標：左室舒張末期內徑(LVEDD)和左室收縮末期內徑(LVESD)，計算左室射血分數(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)。心臟超聲測定后以頸椎脫臼法處死小鼠，并快速采集心肌組織標本，置入-80 ℃凍存待測。

1.5 心肌組織Dvl1、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)和β-連環蛋白(β-catenin)表達檢測 切取-80 ℃保存心肌組織200 mg，勻漿，12 000 r/min離心15 min后取上清液進行蛋白測定。SDS-PAGE凝膠電泳，取1 μg蛋白變性后冷卻，加樣，電泳，轉膜；轉膜后加封閉液，室溫封閉2 h，加入兔抗Dvl1抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗p-GSK-3β抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗B-catenin 抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，加入1∶1 000稀釋的ALP標記的山羊抗兔IgG抗體，37 ℃孵育1 h；漂洗后加顯色劑，避光顯色2～5 min，有顯色條帶出現后用蒸餾水終止顯色反應。以GAPDH作為內參，進行灰度值比較。

2 結果

2.1 益氣活血方對CHF大鼠心功能的影響 藥物干預4周后，與假手術組比較，模型組LVEDD和LVESD增加，LVEF、LVFS減少(P<0.01)；與模型組比較，益氣活血方高劑量組與氯沙坦陽性對照組LVESD縮小(P均<0.01)，益氣活血方高劑量組LVEDD縮小(P<0.05)，益氣活血方低、高劑量組和氯沙坦陽性對照組LVEF和LVFS均升高(P<0.05或<0.01)。結果見表1。

表1 藥物干預4周后各組心功能比較

注：與假手術組比較，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，▲P<0.01。

2.2 益氣活血方對CHF大鼠心肌Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠心肌Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin的表達升高(P均<0.01)；與模型組比較，益氣活血方低、高劑量組和氯沙坦陽性對照組大鼠心肌Dvl1、p-GSK-3β表達下降(P<0.05或<0.01)，益氣活血方高劑量組和氯沙坦陽性對照組心肌β-catenin表達均下降(P均<0.05)。結果見表2。

表2 藥物干預4周后各組心肌Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin表達比較

注：與假手術組比較，*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，▲P<0.01。

3 討論

心衰是各種心臟結構或功能性疾病導致心室充盈和(或)射血能力受損而引起的一組綜合征。其是一個慢性的發展過程，且病因及病機也復雜多變，中醫學在疾病的診療中強調“整體觀念”及“辨證論治”思想，恰恰符合了這種研究思路。關于本病的病因病機，《靈樞·經脈篇》記載為“手少陰氣絕則脈不通，脈不通則血不流。”《景岳全書·驚悸怔忡》云：“心脾血氣本虛，而或為怔忡……心虛血少，神志不寧而驚悸。”《血證論》云：“血積既久，其水乃成。”CHF多發于中老年人，緣由中年之后，臟氣漸衰，或久病體虛，傷耗心氣，導致心臟功能日漸衰竭。現代多數醫家認為，心氣虧虛、瘀血阻滯為本病的關鍵病機[6,7]。CHF發病早期，病變以氣虛血瘀為主；中期在氣虛血瘀的基礎上，繼發痰濁、火熱等致病因素，加劇了患者本身虛實夾雜的病機狀態；晚期久病，陰陽皆損。有關CHF患者中醫證候分布規律研究表明，CHF以氣虛血瘀證為主[8,9]。結合以前的實驗研究，筆者認為益氣活血法是治療心衰的根本。

益氣活血方是本院根據此病機特點研制的中藥制劑。該方組方嚴謹，方中君藥黃芪，功善補氣升陽、利水消腫，故能振奮心陽、化氣利水。黨參、炙甘草健脾益氣為臣藥，能增強黃芪補中益氣之功，以助血行，取“氣為血之帥，氣行則血行”之意。川芎善于活血行氣、赤芍強于散瘀止痛，二者合用后可加強活血化瘀的功用；而祛瘀過猛易傷正，配以養血益氣之品丹參，使祛瘀而不傷正，且三者為同類，可達到相輔相成之效，共為佐藥。五味子和麥冬能養陰護心，滋養心血，與丹參一起避免化瘀藥物走竄耗氣傷津血；茯神甘以入心，功善益氣養血，使心神得養，故均為使藥。諸藥合用，虛實兼顧，攻補兼施，共奏補心益氣、活血利水之功。

近年來大量研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在心肌梗死后心室重塑中持續過度激活，從而加速心衰的進程[10,11]。Wnt/β-catenin信號通路是一條多元復雜的級聯放大信號傳導通路，參與調控多種生物學過程。Dvl1是Wnt/β-catenin信號通路中將胞外信號傳遞到胞內的關鍵性信號分子。當細胞受到外界刺激，Dvl1可通過抑制GSK-3β活性來阻止β-catenin被磷酸化而降解，進而在胞質中大量聚集并入核，啟動下游靶基因的表達并發揮相應的生物學作用[12,13]。β-catenin為Wnt/β-catenin信號通路中起著調控轉錄活性的核心成員，當β-catenin處于高表達狀態時，Wnt/β-catenin信號通路就處于激活狀態，相反則為抑制狀態[14]。GSK-3β是決定胞質內β-catenin磷酸化及穩定的重要激酶，為該信號通路的負性調控因子[15]。研究[16]發現，Wnt/β-catenin信號通路的分子參與并調控完整的心肌細胞從出生到凋亡的各個過程。生理狀態下，Wnt/β-catenin信號通路通常是靜止的，而在心血管疾病狀態下可被異常激活[17]。Dvl-1表達水平增加可誘導心肌細胞的肥大，而心肌肥厚后心室重塑是心衰發生發展的重要環節。在心肌纖維化中，GSK-3β活性明顯增強[18]，而心肌纖維化是心衰的共同病理學改變。在損傷心肌凋亡細胞中，β-catenin水平呈時間依賴性增加[19]。因此，在心肌梗死后CHF的進程中，Wnt/β-catenin信號通路起重要作用。本實驗提示益氣活血方在CHF治療中可抑制Wnt/β-catenin信號通路中Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin的過表達，表明益氣活血方具有改善心功能、延緩心衰發展的療效。

綜上可見，益氣活血方可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路中Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin的過表達來改善心衰早期心肌形態學的重構、心肌纖維化和心臟的舒縮功能，但其具體機制仍需進一步探索。