鼻咽癌組織JAK2、STAT3表達變化及其臨床意義

莊妍，謝小缺，章超

1 安徽省第二人民醫院，合肥230000；2 安徽醫科大學第一附屬醫院；3 安徽醫科大學第二附屬醫院

鼻咽癌是一種發生于鼻咽部黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，全世界每年鼻咽癌新發病例約8萬例，死亡達5萬例[1]。我國鼻咽癌的發病率和病死率均高于世界平均水平。根據全國腫瘤登記中心數據顯示，2014年新發鼻咽癌病例約4.5萬例、死亡約2.4萬例[2]。由于鼻咽癌病灶較為隱匿，早期臨床癥狀無特異性，多數患者就診時已進展至中晚期，放射治療效果較差且易出現局部復發或遠處轉移。因此，深入研究鼻咽癌發生、發展的分子機制，尋找鼻咽癌早期診斷、個體化治療和預后評估的腫瘤標志物具有重要意義。Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)是一種胞質酪氨酸激酶，廣泛參與細胞因子受體超家族成員的信號傳遞。JAK2是JAK家族成員之一，其基因定位于染色體9p24.1，編碼的蛋白具有非受體蛋白酪氨酸激酶活性，能夠參與IL-6、IFN-γ等細胞因子受體信號傳導途徑的信號傳導。有研究表明，乳腺癌組織中存在JAK2信號傳導途徑過度激活現象，通過激活下游的信號通路，促進靶基因表達，如趨化因子2(CCL-2)；而CCL-2能夠招募腫瘤微環境中的腫瘤相關巨噬細胞，從而發揮免疫抑制作用[3]。有研究報道，JAK2信號傳導途徑過度激活可能與鼻咽癌患者預后不良有關[4]，提示JAK2可能參與鼻咽癌的惡性進展。信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)是一種信號轉導蛋白和轉錄激活物，其基因定位于染色體17q21.2，編碼的蛋白主要通過受體酪氨酸激酶磷酸化后活化，以二聚體形式發揮核內靶基因表達調控作用。研究表明，活化的STAT3能夠激活下游細胞因子信號轉導蛋白等基因表達，促進肝癌、鼻咽癌等惡性腫瘤的發生、發展[5]。本研究觀察了鼻咽癌組織JAK2、STAT3 mRNA表達變化，并探討其表達與患者臨床病理特征和預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年2月～2016年2月安徽省第二人民醫院和安徽醫科大學第一附屬醫院收治的鼻咽癌患者85例。所有患者經鼻內鏡下活檢或術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合鼻咽癌診斷；②初診，入院前未接受任何抗腫瘤治療；③一般狀況良好，Karmofsky評分≥70分；④臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標準：①合并心、肝、腎等重要臟器嚴重功能障礙者；②合并其他部位惡性腫瘤或嚴重感染性疾病者；③入院前接受任何抗腫瘤治療者；④近期有外傷或手術史者；⑤臨床病理資料或隨訪資料不完整者。其中，男50例，女35例；年齡18～74(48.1±7.2)歲，≤60歲41例、>60歲44例；有吸煙史28例，無吸煙史57例；組織分化程度：高分化23例，中分化29例，低分化33例；TNM分期[6]：Ⅰ、Ⅱ期61例，Ⅲ、Ⅳ期24例；有淋巴結轉移44例，無淋巴結轉移41例。本研究經安徽省第二人民醫院和安徽醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 JAK2、STAT3 mRNA表達檢測 采用RT-qPCR法。取鼻咽癌組織和癌旁正常組織各50～100 mg，采用TRIzol法提取組織總RNA，經NanoDrop2000超微量分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續實驗。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明，將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明進行PCR擴增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。引物序列：JAK2上游引物5′-TCTGGGGAGTATGTTGCAGAA-3′，下游引物5′-AGACATGGTTGGGTGGATACC-3′；STAT3上游引物5′-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3′，下游引物5′-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3′；GAPDH上游引物5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游引物3′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-5′。PCR反應體系共20 μL：2×SYBR?Premix Ex Taq 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，去離子水3.5 μL；反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s、60 ℃退火60 s、72 ℃延伸30 s共40個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 隨訪 鼻咽癌患者出院后以門診或電話等形式定期隨訪，每3個月隨訪1次，隨訪截至2019年2月，統計患者生存情況，計算3年總體生存率。

2 結果

2.1 鼻咽癌組織與癌旁正常組織JAK2、STAT3 mRNA表達比較 鼻咽癌組織與癌旁正常組織JAK2 mRNA相對表達量分別為1.410±0.232、0.472±0.113，STAT3 mRNA相對表達量分別為0.945±0.137、0.427±0.101。鼻咽癌組織JAK2、STAT3 mRNA相對表達量均明顯高于癌旁正常組織(t分別為26.754、23.261，P均<0.01)。

2.2 鼻咽癌組織JAK2 mRNA表達與STAT3 mRNA表達的關系 Pearson線性相關分析顯示，鼻咽癌組織JAK2 mRNA相對表達量與STAT3 mRNA相對表達量呈正相關關系(r=0.622，P<0.01)。

2.3 鼻咽癌組織JAK2、STAT3 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系 鼻咽癌組織JAK2、STAT3 mRNA相對表達量均與TNM分期有關(P均<0.05)，而與性別、年齡、吸煙史、組織分化程度、淋巴結轉移無關(P均>0.05)。見表1。

表1 鼻咽癌組織JAK2、STAT3 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系

2.4 鼻咽癌組織JAK2、STAT3 mRNA表達與患者預后的關系 截至隨訪日期，共隨訪1～36個月，中位隨訪時間32個月。

以JAK2 mRNA相對表達量的均數1.410為臨界值，將鼻咽癌患者分為JAK2 mRNA高表達者43例、低表達者42例，其3年總體生存率分別為51.2%(21/43)、83.3%(35/42)，JAK2 mRNA高表達者3年總體生存率明顯低于JAK2 mRNA低表達者(χ2=3.874，P<0.05)。見圖1。

以STAT3 mRNA相對表達量的均數0.945為臨界值，將鼻咽癌患者分為STAT3 mRNA高表達者41例、低表達者44例，其3年總體生存率分別為48.7%(20/41)、79.5%(35/44)，STAT3 mRNA高表達者3年總體生存率明顯低于STAT3 mRNA低表達者(χ2=4.916，P<0.05)。見圖2。

圖1 鼻咽癌不同JAK2 mRNA表達者的生存曲線

3 討論

鼻咽癌是起源于鼻咽部黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，其發生可能是環境因素和遺傳因素共同作用的結果[7]。目前認為，鼻咽癌是一種多基因遺傳性疾病，其發生、發展可能涉及細胞內多條細胞信號傳導通路的異常改變，如Wnt通路、Akt通路等[8]，但其確切分子機制仍不十分清楚。因此，深入研究鼻咽癌發生、發展的分子機制，尋找鼻咽癌早期診斷、個體化治療和預后評估的腫瘤標志物具有重要意義。

圖2 鼻咽癌不同STAT3 mRNA表達者的生存曲線

JAK2為JAK家族成員之一，其基因定位于染色體9p24.1，編碼的蛋白具有非受體蛋白酪氨酸激酶活性，通過參與IL-6、IFN-γ等細胞因子受體信號傳導途徑的信號傳導，參與調控細胞增殖、凋亡等生物學行為[9]。近年研究發現，JAK2異常表達能夠促進腫瘤血管生成、上皮間質轉化和細胞外基質降解等，參與腫瘤的發生、發展過程[10]。逄明杰等[11]研究發現，鼻咽癌組織JAK2異常高表達，其高表達與患者預后不良有關。本研究結果發現，鼻咽癌組織JAK2 mRNA相對表達量明顯高于癌旁正常組織，進一步證實JAK2異常高表達與鼻咽癌的發生密切相關。這可能與腫瘤微環境中M2型腫瘤相關巨噬細胞分泌產生IL-17，而IL-17能夠作用于腫瘤細胞表面相應受體，通過激活細胞內JAK2表達促進下游信號傳導[12]。此外，腫瘤的發生、發展過程中存在多種調控JAK2表達的微小RNA異常表達，如能夠結合于JAK2信使RNA的3′端非翻譯區的miR-375，其異常低表達可導致JAK2表達升高[13]。本研究發現，鼻咽癌組織JAK2 mRNA相對表達量與TNM分期有關，而與性別、年齡、吸煙史、組織分化程度、淋巴結轉移無關。表明JAK2異常表達與鼻咽癌TNM分期有關，其機制可能與JAK2表達升高能夠促進下游細胞信號轉導通路活化，如PI3K/AKT信號通路，導致上皮間質轉化相關基因表達異常，從而促進腫瘤惡性進展[14]。本研究發現，JAK2 mRNA高表達者3年總體生存率明顯低于JAK2 mRNA低表達者，提示JAK2高表達可能與鼻咽癌患者預后不良有關。這可能與JAK2高表達的腫瘤細胞侵襲能力明顯增強有關。

STAT3是一種信號轉導蛋白和轉錄激活物，其基因定位于染色體17q21.2，編碼的蛋白主要通過受體酪氨酸激酶磷酸化后活化，形成同源性二聚體結構，由細胞質轉運至細胞核，發揮核內靶基因表達調控作用。有研究報道，鼻咽癌組織STAT3表達明顯升高，其表達變化與腫瘤分期、淋巴結轉移和患者預后有關[15]。本研究結果發現，鼻咽癌組織STAT3 mRNA相對表達量明顯高于癌旁正常組織，進一步證實STAT3異常高表達與鼻咽癌的發生密切相關，其機制可能是調控STAT3表達的上游細胞信號傳導通路過度活化，如JAK2信號傳導通路等，從而導致STAT3表達增加。此外，STAT3表達還受一些內源性抑制因子的調控，如STAT3的內源性抑制因子細胞因子信號抑制因子1(SOCS1)。SOCS1能夠抑制STAT3表達，進而抑制下游信號傳導通路活化[16]。有研究表明，STAT3能夠抑制參與DNA修復相關基因Jab1/Csn5表達，導致腫瘤惡性進展，并且降低腫瘤細胞對放化療的敏感性[17]。本研究結果發現，鼻咽癌組織JAK2 mRNA相對表達量與TNM分期有關，而與性別、年齡、吸煙史、組織分化程度、淋巴結轉移無關。表明STAT3異常表達與鼻咽癌TNM分期有關，其原因可能與STAT3能夠參與調控腫瘤相關基因表達有關。本研究發現，STAT3 mRNA高表達者3年總體生存率明顯低于STAT3 mRNA低表達者，其原因可能是上游轉錄因子等直接促進STAT3表達，如DNA甲基轉移酶1、Zeste同源染色體2增強子基因等，從而促進鼻咽癌細胞無限增殖，進而導致患者預后不良[18]。

本研究還發現，鼻咽癌組織JAK2 mRNA相對表達量與STAT3 mRNA相對表達量呈正相關關系，提示二者可能共同促進腫瘤進展。目前，二者在鼻咽癌中確切的相互作用機制尚不清楚，可能是JAK2在受到上游信號激活后，STAT3被磷酸化而活化，導致下游Bax/Bcl-xL升高，從而促進腫瘤細胞增殖并抑制其凋亡，同時促進上皮間質轉化等，繼而導致腫瘤惡性轉化[19]。

綜上所述，鼻咽癌組織JAK2、STAT3高表達，其表達變化與TNM分期和患者預后有關。JAK2、STAT3有可能成為診斷鼻咽癌的腫瘤標志物和治療靶標。