雷替曲塞對人結腸癌細胞SW480增殖、凋亡的影響及其機制

賀許良，黃英，曾良玉，易小龍，李文俊，張樹友

1長沙醫學院附屬株洲市人民醫院，湖南株洲 412000；2南華大學附屬南華醫院

結直腸癌是消化道的常見惡性腫瘤，且隨著人們生活水平的不斷提高和飲食習慣的改變，近年其發病率呈現出逐年上升的趨勢[1,2]。2017年美國癌癥協會數據統計，結直腸癌的發病率位居所有惡性腫瘤第三[3]。目前，臨床上治療此類疾病最直接有效的方法仍以手術為主[4,5]，但患者術后5年生存率僅為65%[6]，且不僅復發率及轉移率較高，對中晚期患者的治療效果也較差[7]。為提高此類患者的治療效果，化療仍是主要的輔助治療手段。雷替曲塞作為一種特異性胸苷酸合成酶(TS)抑制劑能夠選擇性抑制TS，從而對抗腫瘤細胞的增殖，近年被廣泛應用于惡性腫瘤的輔助治療[8～11]，但其對結直腸癌細胞的具體作用機制尚不完全清楚。2017年6月～2019年6月，本研究觀察了雷替曲塞對人結腸癌細胞(SW480)增殖、凋亡的影響，以期為其臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 SW480購自上海一研生物科技有限公司；雷替曲塞(2 mg/支，批號H20090325)購自正大天晴藥業集團股份有限公司；RPMI1640培養基(批號350-000-CL)、胎牛血清(批號086150013)購自維森特生物技術(南京)有限公司；兔抗人Bax(批號20151209)、Bcl-2(批號20140608)及Caspase-3單克隆抗體(批號20130908)購自美國ABcam公司；胰蛋白酶、PBS、CCK-8試劑盒、RIPA蛋白裂解液等由碧云天生物技術研究所配制；羊抗兔β-actin內參、BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜、ECL發光檢測試劑盒等購自南京凱基生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司設計及合成；細胞培養超凈工作臺購自上海成永實驗室設備有限公司；CO2恒溫細胞培養箱購自上海新苗醫療器械制造有限公司；4 ℃低溫高速離心機購自德國Beckman公司；自動酶標讀數儀、流式細胞儀等購自美國Bio Tek儀器有限公司；RT-PCR儀購自美國Thermo公司。

1.2 細胞培養 ①細胞復蘇：超凈工作臺臺面于紫外線照射30 min 后，將SW480凍存管迅速從液氮罐中取出，并置于37 ℃水浴箱中進行解凍。融化后取出凍存管，并用75%乙醇棉球擦拭其外壁。用移液槍吹打細胞液分散細胞后，用吸管吸出細胞液置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中混勻，放在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。②細胞培養與傳代：待細胞貼壁后，更換新鮮培養液后繼續培養，每3 d更換1次培養液，當細胞生長密度達80%左右且生長狀態良好時進行傳代培養。棄掉培養液，加入PBS溶液反復沖洗后，加入胰蛋白酶500 μL，待顯微鏡下觀察到細胞變圓、亮度增加且出現明顯細胞間隙時吸去胰酶，加入10%胎牛血清終止消化。再次吹打至細胞形成懸液后，加入培養液并按1∶3的比例進行分瓶繼續培養。③細胞凍存：待細胞處于對數生長期時，更換新鮮培養液1 d后，按上述細胞傳代方式進行細胞消化，消化結束后取細胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄上清后加入凍存液，分裝至凍存管中，注明細胞種類、代系及凍存時間，分別放入4 ℃冰箱2 h、-20 ℃冰箱3 h、-80 ℃冰箱過夜后置入液氮罐中保存。

1.3 細胞分組 將SW480隨機分為A組、B組、C組與對照組，0.25%胰蛋白酶消化并于培養液中重新形成單細胞懸液后置于6孔板中進行培養(每組設定5個復孔)，其中A組SW480培養液中加入0.1 μg/mL雷替曲塞,B組SW480培養液中加入0.5 μg/mL雷替曲塞,C組SW480培養液中加入2.5 μg/mL雷替曲塞,對照組單純加入等量培養液。

1.4 細胞增殖檢測 分別取孵育24、48、72 h各組SW480，采用CCK-8試劑盒嚴格按說明書操作流程檢測細胞增殖活性，并用酶標儀測定450 nm處的光密度(OD)值，每組重復測定5次取平均值，以OD值表示相對細胞增殖活性。

1.5 克隆情況觀察 將6孔板內貼壁生長的細胞置于37 ℃、5% CO2條件下培養10 d，采用PBS清洗后，用10%的甲醛固定10 min，行吉姆薩染色；染色后，于倒置顯微鏡下觀察細胞克隆情況，并對>50個的細胞進行計數后計算克隆形成率(每組重復測定5次取平均值)。克隆形成率(%)=細胞克隆數/接種細胞數×100%。

1.6 細胞Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR技術。細胞孵育72 h后取出6孔板，棄去培養基，加入TRIzol Regent，吹打至細胞全部裂解并靜置5 min后加入0.2 mL氯仿作用3 min； 4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上層清液加入0.5 mL異丙醇，靜置10 min后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄去上層清液；加入75%乙醇1 mL混勻后4 ℃ 7 500 r/min離心5 min，棄去上層清液，風干10 min；加入DEPC水20 μL，55 ℃金屬浴10 min；提取樣品分別檢測其在260 nm及280 nm波長吸光度(A)值，A260/A280值在1.8～2.0視為RNA提取合格；在冰上按照順序將RNA、Oligo(dT)18引物、DEPC水、Reaction Buffer等加入PCR管中混勻后42 ℃恒溫孵育60 min、70 ℃恒溫孵育5 min；準備PCR 板，配置總體積為5 μL的反應體系(其中上游和下游引物各10 pmol)，95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s預變性40個循環。采用2-ΔΔCt法計算Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA的相對表達量(每組重復測定5次取平均值)。

1.7 細胞Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白檢測 采用Western Blotting法。細胞孵育72 h后，棄去細胞培養液，采用PBS沖洗3次，加入預冷細胞裂解液裂解、混勻，并冰浴15 min；冰浴后，依次勻漿，12 000 r/min離心15 min；提取總蛋白，采用紫外分光光度計測定總蛋白濃度，繪制蛋白濃度標準曲線。取蛋白上樣與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混勻后100 ℃加熱10 min進行蛋白變性，置于-20 ℃環境下保存備用。SDS-PAGE凝膠制作后加入等體積蛋白上樣電泳、轉膜、封閉，置于4 ℃環境下孵育一抗過夜；一抗孵育后，PBST洗膜3次，然后加入二抗，室溫下孵育60 min；二抗孵育后，PBST洗膜3次，并曝光顯影；最后用圖像分析軟件Image J檢測蛋白條帶灰度值(每組重復測定5次取平均值)。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較 見表1。

表1 各組細胞孵育不同時間OD值比較

注：與本組24 h相比，aP<0.05；與對照組同時點相比，bP<0.05；與A組同時點相比，cP<0.05。

2.2 各組細胞克隆形成率比較 細胞孵育10 d后，對照組、A組、B組、C組SW480克隆形成率分別為(81.03±5.32)%、(45.83±4.28)%、(31.05±3.75)%、(22.99±2.63)%，組間兩兩比較，P均<0.05。

2.3 各組細胞Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA表達比較 隨著雷替曲塞濃度的增加，SW480 Bax及Caspase-3 mRNA表達升高，Bcl-2 mRNA表達降低，詳見表2。

2.4 各組細胞Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白表達比較 隨著雷替曲塞濃度的增加，SW480 Bax及Caspase-3蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，詳見圖1，表3。

表2 各組細胞Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA表達比較

注： 與對照組相比，aP<0.05；與A組相比，bP<0.05；與B組相比，cP<0.05。

圖1 各組Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達條帶圖

表3 各組細胞Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白表達比較

注： 與對照組相比，aP<0.05；與A組相比，bP<0.05；與B組相比，cP<0.05。

3 討論

流行病學研究顯示，全球每年新發結直腸癌病例高達93萬，嚴重威脅人類健康，且大部分患者在發現腫瘤時已存在轉移，采取手術治療一般很難根治，必須采取化療的方法延長患者的生存期[12，13]。雷替曲塞作為一種抗代謝藥物，因其副作用較小、效果顯著,被廣泛應用于結直腸癌的輔助治療，但有關其具體作用機制的相關文獻較少。

腫瘤細胞的增殖及克隆形成反映了細胞轉移能力的強弱[14]。有學者研究發現，雷替曲塞可將胃癌細胞S期的比例上升，從而將細胞進程阻滯在G0/G1期，誘導癌細胞凋亡，并且明顯抑制人胃癌細胞MGC-803裸鼠移植瘤生長[15]。本研究發現，隨著雷替曲塞濃度的增加以及干預時間的延長,SW480的增殖速度減慢，且在濃度達到一定程度后，該現象不再明顯。此外，不同濃度的雷替曲塞對SW480癌細胞株的增殖和克隆體形成影響不同，克隆形成率隨雷替曲塞濃度的增加依次減少。

細胞凋亡的過程可概括為凋亡誘導、調控執行及效應三個階段。研究顯示，細胞凋亡的發生與線粒體、死亡受體和內質網密切相關[16]。如啟動型Caspase可結合特異輔助因子，激活效應型下游Caspase，從而降解細胞內蛋白，最終導致細胞發生不可逆性死亡[17]；位于線粒體膜、內質網膜和核膜上的Bcl-2蛋白，作為Caspase-3的直接作用底物，可被其裂解為促凋亡功能片段，從而瀑布樣促進細胞的凋亡[18]。周正等[19]發現，SH2B1在肝癌細胞株HepG2中高表達，沉默SH2B1表達可調控凋亡相關蛋白表達促進肝癌細胞株HepG2細胞凋亡，抑制肝癌細胞生長速度。張九成等[20]研發發現，甘草查爾酮A作用于人結腸癌HCT116和SW480細胞，能顯著上調促凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白活化片段Cleaved-Caspase-3的表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，隨著甘草查爾酮A濃度及時間的延長，人結腸癌細胞的增殖抑制率增大，呈現濃度和時間依賴性，可能的作用機制為激活氧化應激和調控Bcl-2、Bax與Caspase-3信號通路。封革等[21]研究發現，雷替曲塞干預微衛星高度不穩定性(MSI-H)結腸癌細胞株后，促凋亡蛋白Caspase-3、Bax等的表達明顯增加，而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯降低。本研究結果顯示，隨著雷替曲塞濃度的增加，Bax及Caspase-3蛋白及mRNA的表達明顯升高，Bcl-2蛋白及mRNA表達明顯降低，與上述研究結果相似。

綜上所述，雷替曲塞可通過調節SW480 Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白及其mRNA的表達激活細胞凋亡通道，抑制細胞增殖，誘導結腸癌細胞凋亡，這將為臨床治療提供重要理論依據，其具體作用機制仍需要進一步深入研究。