外源刀豆凝集素對菲律賓蛤仔免疫機能的影響

田園 李瑩 張艷麗 于欣 李金龍

摘要? ? 為了解外源刀豆凝集素對菲律賓蛤仔免疫因子的影響，開展了不同濃度刀豆凝集素對菲律賓蛤仔血細胞吞噬活性、溶菌酶（LSZ）、堿性磷酸酶（AKP）和超氧化物歧化酶（SOD）的影響研究。結果表明，投喂刀豆凝集素后第1、3、4、6、7天，菲律賓蛤仔吞噬細胞活性顯著高于對照普通養(yǎng)殖（P<0.05）;投喂5 μg/L刀豆凝集素后第4、6、7天，菲律賓蛤仔溶菌酶含量顯著高于對照普通養(yǎng)殖（P<0.05）;投喂刀豆凝集素后第1～7天，菲律賓蛤仔堿性磷酸酶活性顯著高于對照普通養(yǎng)殖（P<0.05）;投喂5 μg/L刀豆凝集素后第3、7天，菲律賓蛤仔的超氧化物歧化酶活性顯著高于對照普通養(yǎng)殖（P<0.05）。刀豆凝集素在第2～5天對菲律賓蛤仔免疫力具有很大的促進作用，3 μg/L刀豆凝集素效果最佳，第7天后投喂5 μg/L刀豆凝集素效果最佳。

關鍵詞? ? 菲律賓蛤仔;刀豆凝集素;免疫機能

中圖分類號? ? S917? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）08-0221-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract? ? In order to understand the effect of exogenous concanavalin on the immune factors of Ruditapes philippinarum，the effects of different concentrations of concanavalin on blood cells phagocytic activity，lysozyme（LSZ），alkaline phosphatase（APK）and superoxide dismutase（SOD）of R. philippinarum were studied.The results showed that on 1st，3th，4th，6th and 7th day after feeding concanavalin，the phagocytic activity of R. philippin-arum was significantly higher than the control（P<0.05）;On 4th，6th and 7th day after feeding 5 μg/L concanavalin，the LSZ content of R. philippin-arum was significantly higher than the control（P<0.05）;From 1th to 7th day after feeding concanavalin，the APK activity of R. philippinarum was significantly higher than the control（P<0.05）;On 3th and 7th day after feeding 5 μg/L concanavalin，the SOD activity of R. philippinarum was significantly higher than the control（P<0.05）.Concanavalin had a great effect on promoting the immunity of R. philippinarum from the 2nd to the 5th day，the best concentration of concanavalin was 3 μg/L.The best concentration of feeding concanavalin was 5 μg/L after the 7th day.

Key words? ? Ruditapes philippinarum;concanavalin;immune function

菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）隸屬于軟體動物門（Mollusca）雙殼綱（Bivalvia）簾形目（Venerida）簾蛤科（Ve-neridae）蛤仔屬（Ruditapes）[1]，因其肉味鮮美、營養(yǎng)豐富，富含維生素及礦物質(zhì)，深受人們的喜愛。菲律賓蛤仔為我國四大養(yǎng)殖貝類之一，年產(chǎn)量約300萬t，約占世界蛤仔總產(chǎn)量的90%[2]。隨著人民生活水平的提高，市場對菲律賓蛤仔的需求逐年增加。

凝集素是指從植物、無脊椎動物和高等動物中提取的糖蛋白或結合糖蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質(zhì)）而得名。至今發(fā)現(xiàn)的植物凝集素有1 000種以上[3]，豆科植物凝集素種類逾600種，其中逾70種已被分離純化[4]。植物凝集素不僅具有免疫反應、信號轉導、植物防御等諸多重要作用，同時具有細胞凝集、抗病毒、抗真菌及誘導細胞凋亡或自噬等多種能力。近年來，植物凝集素作為一種免疫增強劑已在水產(chǎn)動物中廣泛應用。張? 靜等[5]初步研究發(fā)現(xiàn)，凝集素對增強鯽的非特異性免疫力具有重要作用。李丹彤等[6]研究發(fā)現(xiàn)，裙帶菜凝集素對日本對蝦免疫機能具有一定的促進作用。熊川男等[7]研究發(fā)現(xiàn)，凝集素對海參免疫因子有一定的影響。李丹彤等[8]研究了不同海藻凝集素對鯉免疫活性物的誘導作用。關于凝集素對貝類的免疫機能影響的相關報道較少[9]，本試驗研究刀豆凝集素對菲律賓蛤仔免疫相關指標的影響，以期為經(jīng)濟貝類的苗種繁育、養(yǎng)殖及凈化免疫促進劑的研發(fā)提供參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

供試材料為大連金州野生群體蛤仔。將蛤仔運輸?shù)綄嶒炇液螅瑫吼B(yǎng)3 d，暫養(yǎng)水溫為15 ℃，pH值為8.0，鹽度為30。蛤仔殼長平均規(guī)格為（3.56±0.36）cm。將刀豆凝集素配置為濃度為5 mg/L的母液。

1.2? ? 試驗方法

試驗設3個處理，即將蛤仔分別養(yǎng)殖在刀豆凝集素濃度為3 μg/L（A）和5 μg/L（B）的過濾海水中，并設置普通養(yǎng)殖為對照（CK）。試驗水槽體積為30 L，每天全量換水1次，每天投喂金藻與小球藻，投喂量分別為25萬個/mL，每天取樣1 次，用液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存，試驗持續(xù)7 d。

1.3? ? 調(diào)查內(nèi)容與方法

分別測定各處理的細胞總數(shù)、溶菌酶酶活性、堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶。

1.3.1? ? 血細胞總數(shù)測定。按2%氯化鈉、1%乙酸鈣和4%甲醛配制成Baker′s formol calcium（BEC）固定液，吸取30 μL血淋巴細胞樣品加入到30 μL BFC固定液中。將固定的樣品放置于血球計數(shù)板，在10倍光學顯微鏡（CX21FS1）下觀察計數(shù)。

1.3.2? ? 血細胞吞噬活性。血細胞吞噬活性采用Hannam等[10]的方法，首先取50 μL血淋巴細胞樣品加入到96孔酶標板中，將酶標板于4 ℃孵育1 h，孵育后取100 μL貝類生理鹽水沖洗黏附血細胞，重復清洗2次，加入50 μL中性紅染過的酵母懸液（50×107個/mL），于20 ℃孵育30 min之后，加入100 μL BFC終止反應。使用生理鹽水（滅菌的海水）洗去多生物大分子、無機物顆粒、細菌、真菌、自身的壞死細胞及細胞碎片等[11-14]。關于凝集素能夠促進水產(chǎn)動物的血細胞的吞噬活性已有較多報道，有研究表明，龍蝦的凝集素能夠促進血淋巴細胞的吞噬功能。彭其勝等[15]對中國對蝦血淋巴凝集素的血凝活性與促噬活性研究發(fā)現(xiàn)凝集素對血細胞吞噬活性具有促進作用。李丹彤等[6]在裙帶菜對日本對蝦影響研究中表明，日本對蝦吞噬活性在第3天時達到最高，指出植物凝集素在第3天時對無脊椎動物吞噬細胞影響最大。本研究中，在蛤仔養(yǎng)殖水體中加入3 μg/L和5 μg/L刀豆凝集素可在早期促進蛤仔血細胞吞噬活性，說明外源刀豆凝集素對蛤仔具有一定的免疫促進作用。

溶菌酶可與帶負電荷的病毒蛋白直接結合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白等形成復鹽，進而使病毒失活。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用[12]。本研究中，刀豆凝集素處理在第4天與第6天對溶菌酶活性的影響效果最顯著，其中5 μg/L刀豆凝集素處理明顯高于3 μg/L刀豆凝集素處理、普通養(yǎng)殖對照，前期凝集素對蛤仔中溶菌酶活性促進效果并不明顯，而凝集素處理第4天時效果最佳，并且5 μg/L刀豆凝集素處理效果高于3 μg/L刀豆凝集素處理。在外源刀豆凝集素處理蛤仔的條件下，蛤仔的溶菌酶活性基本呈下降趨勢，這與張? 靜等[5]在裙帶菜凝集素對鯽的免疫誘導研究中得出凝集素作用下溶菌酶活性呈降低趨勢的結果一致。

堿性磷酸酶是一種重要的代謝調(diào)控酶，直接參與磷酸基團的轉移和機體白質(zhì)的合成，也是溶酶體酶的重要組成部分[14-17]。超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶之一，在清除自由基、預防生物分子損傷等方面有重要作用，也與生物的免疫水平密切相關[15-21]。Rawal等[22]報道了阿米巴Gal/GalNAc專一凝集素對MAPK 激酶途徑有激活作用。李丹彤等[20]在對3種海藻凝集素對刺參組織超氧化物歧化酶活性的影響研究中發(fā)現(xiàn)，裙帶菜凝集素、孔石莼凝集素處理5 d后，刺參體內(nèi)超氧化物歧化酶活性均呈現(xiàn)上升趨勢。本研究結果表明，刀豆凝集素對蛤仔中堿性磷酸酶具有很大的促進作用，3 μg/L刀豆凝集素處理后蛤仔體內(nèi)的堿性磷酸酶活性較高。投喂刀豆凝集素第2天時，3 μg/L與5 μg/L刀豆凝集素處理超氧化物歧化酶活性已明顯高于對照普通養(yǎng)殖，說明外源刀豆凝集素對蛤仔具有一定的免疫促進作用。

本研究結果表明，投喂刀豆凝集素后2～5 d，刀豆凝集素對蛤仔免疫促進效果最佳，在養(yǎng)殖水體中投放3 μg/L和5 μg/L外源刀豆凝集素對蛤仔均有一定的免疫促進作用。

4? ? 參考文獻

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