羥考酮對瑞芬太尼致切口痛大鼠痛覺敏化的干預機制研究

盧洋 王子一 楊秀娟

【摘要】 目的：觀察羥考酮對瑞芬太尼致切口痛大鼠痛覺敏化的干預機制。方法：選擇健康雄性SD大鼠40只，按照隨機數字表法分為5組，每組各8只：切口痛+瑞芬太尼+羥考酮組[I+R+O組，切口痛模型建立前30 min皮下注射10 μg/kg羥考酮，建立切口痛模型同時經尾靜脈輸注瑞芬太尼1.2 μg/（kg·min）];切口痛+羥考酮組（I+O組，切口痛模型建立前30 min皮下注射10 μg/kg羥考酮）;切口痛+瑞芬太尼（I+R組，建立切口痛模型同時經尾靜脈輸注瑞芬太尼1.2μg/（kg·min）]、切口痛（I組，建立切口痛模型）、空白對照組（C組，皮下注射等量生理鹽水）。采用全自動熱痛刺激儀和Von Frey纖毛機械刺激針測量各組大鼠術前24 h（T0）、術后6 h（T1）、術后24 h（T2）、術后48 h（T3）測定左后足的熱縮足反射潛伏期（PWTL）和機械縮足反射閾值（PMW）。Western免疫印跡檢測L4～5脊髓背角磷酸化NR2B表達。結果：T1～T3時刻，與I組比較，I+R組大鼠PWTL值明顯減小，差異均有統計學意義（P<0.05）;T1～T2時刻，與I+R組比較，I+R+O組大鼠PWTL值明顯增大，差異均有統計學意義（P<0.05）;T1～T3時刻，與I組比較，I+R組大鼠PMW值明顯減小，差異均有統計學意義（P<0.05）;T1～T3時刻，與I+R組比較，I+R+O組大鼠PMW值明顯增大，差異均有統計學意義（P<0.05）。Western免疫印跡檢測顯示，與I組比較，I+R組術后48 h L4～5脊髓背角磷酸化NR2B表達增加，差異有統計學意義（P<0.05）;與I+R組比較，I+R+O組術后48 h L4～5脊髓背角磷酸化NR2B表達減少，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：瑞芬太尼可誘發切口痛大鼠痛覺敏化，而羥考酮可以有效緩解痛覺敏化，這一作用機制可能與抑制脊髓背角NMDA受體亞基NR2B磷酸化有關。

【關鍵詞】 羥考酮 瑞芬太尼 切口痛 大鼠 痛覺敏化

[Abstract] Objective： To observe intervention mechanism of oxycodone on pain sensitization in rats with incision pain caused by remifentanil. Method：A total of 40 healthy male SD rats were randomly divided into 5 groups （8 cases in each group）： incision pain + Remifentanil + Oxycodone group [I + R + O group， subcutaneous injection of 10 μg/kg Oxycodone at 30 min before establishment of incision pain model， instilling Remifentanil

1.2 μg/（kg·min） by tail vein while establishing incision pain model]， incision pain + Oxycodone group （I + O group， subcutaneous injection of 10 μg/kg Oxycodone at 30 min before establishment of incision pain model）， incision pain + Remifentanil [I + R group， instilling Remifentanil 1.2 μg/（kg·min） by tail vein while establishing incision pain model]， incision pain group （I group， establishment of incision pain model） and blank control group （group C， subcutaneous injection of the same amount of normal saline）. At 24 h before surgery （T0）， at 6 h after surgery （T1）， at 24 h after surgery （T2） and at 48 h after surgery （T3）， full-automatic heat pain stimulator and Von Frey Hairs were applied to measure paw withdrawal thermal latency （PWTL） and mechanical withdrawal threshold （PMW） of left hindfoot in both groups. Western blotting was applied to detect expression of phosphorylated NR2B in the spinal dorsal horn of L4-5. Result： At T1-T3， compared with group I， the PWTL value of rats in group I + R decreased significantly （P<0.05）. At T1-T2， compared with the I + R group， the PWTL value of the I + R + O group increased significantly （P<0.05）. At T1-T3， compared with I group， the PMW value of rats in group I+R decreased significantly （P<0.05）. At T1-T3， compared with the I + R group， the PMW value of the rats in the I + R + O group increased significantly （P<0.05）. Western Blot showed that compared with group I， NR2B phosphorylation in L4-5 dorsal horn of spinal cord in I + R group increased 48 h after surgery， with statistically significant difference （P<0.05）. Compared with the I + R group， NR2B phosphorylation in L4-5 dorsal horn of spinal cord decreased 48 h after surgery in the I + R + O group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Remifentanil can induce pain sensitization in rats with incision pain， and oxycodone can effectively alleviate pain sensitization. This action mechanism may be related to inhibiting phosphorylation of NMDA receptor subunit NR2B in spinal dorsal horn.[Key words] Hydroxycodone Ruifentaini The incision is painful Rat Pain sensitivityFirst-authors address： Jiamusi University， Jiamusi 154000， China

瑞芬太尼是一種具有較強鎮痛作用的超短效阿片μ受體激動劑，在臨床麻醉及疼痛治療領域應用普遍，但由于其鎮痛效應消失迅速，可能誘發術后痛覺敏化[1]。這一效應在很大程度上限制了瑞芬太尼在臨床的應用，目前對其發生機制尚未完全清楚，如何有效預防及治療瑞芬太尼誘發的痛覺敏化已成為臨床研究的熱點。N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體是疼痛傳導的主要調節受體，在中樞敏化過程中背角神經元NMDA受體的激活被認為是關鍵環節[2]。有研究認為，瑞芬太尼致切口痛大鼠痛覺敏化的作用機制可能與促進NMDA受體向胞膜轉運增加及NMDA受體磷酸化有關[3]。羥考酮是μ和κ雙受體激動劑，具有鎮痛、鎮靜、抗焦慮、鎮咳等多重作用，臨床適用于中度疼痛的治療[4-5]。目前尚無研究報道羥考酮對瑞芬太尼誘發的痛覺敏化有防治作用，本研究旨在觀察羥考酮對瑞芬太尼致切口痛大鼠痛覺敏化的影響，并分析這一作用是否與NMDA受體轉運有關，為臨床應用提供參考，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 （1）動物選擇：健康雄性SD大鼠40只，體重220～250 g，2～3月齡，購自中南大學試驗動物中心。24 h晝夜節律，自由飲食，光照時間8：00～20：00，溫度24～26 ℃。實驗前飼養動物1周，以適應環境。（2）試劑與器械：羥考酮（北京華素制藥股份有限公司，國藥準字H20090228，規格：2 mL︰20 mg，生產批號090228）;瑞芬太尼（宜昌人福藥業有限責任公司，國藥準字H20030197，規格：1 mg，生產批號100198）;七氟醚（美國百特國際有限公司，國藥準字H20080680，規格：120 mL，生產批號S062G721）;BME-410A型全自動熱痛刺激儀（中國醫學科學院醫學工程研究所，天津）;Von Frey纖毛機械刺激針（Stoelting公司，美國）;膜蛋白提取試劑盒（Thermo公司，美國）。

1.2 模型建立 大鼠吸入3%七氟醚麻醉，三頭肌肌注30 000 IU青霉素，保持自主呼吸。用10%碘伏消毒大鼠左后足，用11號刀片在跖肌位置作長約1 cm的縱向切口切開皮膚和筋膜，用眼科鑷將足底肌肉挑起，從離腳后跟0.5 cm處向腳趾方向延伸，保持肌肉起止與附著處完整，按壓止血后，用4-0線褥式縫合皮膚，術后用碘伏消毒切口，并用金霉素軟膏覆蓋預防感染。將大鼠置于安靜、溫暖、閉強光環境中繼續喂養5 d。

1.3 實驗分組與處理 采用隨機數字表法將實驗大鼠分為5組，每組各8只。（1）切口痛+瑞芬太尼+羥考酮組（I+R+O組）：切口痛模型建立前30 min皮下注射10 μg/kg羥考酮，建立切口痛模型同時經尾靜脈輸注瑞芬太尼1.2 μg/（kg·min），輸注時間90 min;（2）切口痛+羥考酮組（I+O組）：切口痛模型建立前30 min皮下注射10 μg/kg羥考酮;（3）切口痛+瑞芬太尼（I+R組）：建立切口痛模型同時經尾靜脈輸注瑞芬太尼1.2 μg/（kg·min），輸注時間90 min;（4）切口痛（I組）：建立切口痛模型;（5）空白對照組（C組）：皮下注射等量生理鹽水。

1.4 行為學觀察 模型建立前5 d起，每天將大鼠置于觀察箱內1次，使其適應實驗環境。并于術前24 h（T0）、術后6 h（T1）、術后24 h（T2）、術后48 h（T3）測定左后足的熱縮足反射潛伏期（PWTL）和機械縮足反射閾值（PMW）。（1）PWTL測定：用BME-410A型全自動熱痛刺激儀將光輻射焦點對準大鼠左足跖底中部，打開光源照射，記錄大鼠出現抬足或逃走的潛伏期為PWTL值，連續測定3次，取平均值。實驗中為防止熱輻射損傷，熱刺激強度保持相同，光照最長時間限定為30 s。（2）PMW測定：以不同力度于術側大鼠切口旁0.5 cm處用Von Frey纖毛機械刺激針刺激大鼠足底，從2.0 g開始按升序序列重復刺激10次，連續超過5次爪回縮的最小細絲數值為PMW值。

1.5 Western免疫印跡檢測L4～5脊髓背角磷酸化NR2B表達 行為學測定完成后，立即在七氟醚深麻醉下取脊髓腰膨大L4～5節段。用膜蛋白提取試劑盒提取各組胞膜蛋白，用胰酶消化后，加入預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，加入200 μL冰預冷裂解緩沖液，充分吹打，4 ℃孵育30 min，同時每隔5 min渦旋震蕩10 s，充分裂解。4 ℃，1 000 r/min離心3 min，離心半徑10 cm，取上清分裝，-70 ℃保存備用。將樣本用裂解緩沖液稀釋至相同濃度，取適量的上樣緩沖液于試管中，蛋白量70 μg，煮沸5 min使其變性，-20 ℃保存。取適量凝膠置于轉移緩沖液中平衡15 min，加樣至10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白后，用濕電轉移法（轉移電壓100 V，恒流200 mA，電轉1 h）將蛋白轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜在室溫5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h。洗膜后加入封閉液和適量一抗（1︰1 000），搖蕩孵育4 ℃過夜，TBST緩沖液（含吐溫20的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水）清洗5次，5 min/次。將膜與辣根過氧化氫（HRP）結合的二抗（1︰5 000）室溫下搖蕩孵育1 h，TBST緩沖液清洗5次，5 min/次。按0.1 mL/cm2計算顯影液用量，將顯影液加于PVDF膜上，室溫靜置1 min，用保鮮膜將膜包好，盡量避免氣泡。暗室內迅速將膜蛋白貼在X光膠片上顯色曝光，掃描成像。采用Gene Tools圖像分析軟件（SyNGENE公司，英國）測定條帶灰度值，分析結果。

1.6 統計學處理 使用SPSS 19.0統計學軟件進行處理數據，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，不同時間點比較采用重復測量方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時刻PWTL值變化情況比較 T0時刻各組大鼠PWTL值比較差異均無統計學意義（P>0.05）;T1～T3時刻，與C組比較，I組大鼠PWTL值明顯減小，差異有統計學意義（t=4.154、16.756、3.201，P<0.05）;T1～T3時刻，與I組比較，I+R組大鼠PWTL值明顯減小，差異均有統計學意義（t=15.365、16.053、15.066，P<0.05）;T1～T3時刻，與I組比較，I+O組大鼠PWTL值差異均無統計學意義（P>0.05）;T1～T2時刻，與I+R組比較，I+R+O組大鼠PWTL值明顯增大，差異均有統計學意義（t=3.785、3.188，P<0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠不同時刻PMW值變化情況比較 T0時刻各組大鼠PMW值比較，差異均無統計學意義（P>0.05）;T1～T3時刻，與C組比較，I組大鼠PMW值明顯減小，差異均有統計學意義（t=25.126、5.447、5.167，P<0.05）;T1～T3時刻，與I組比較，I+R組大鼠PMW值明顯減小，差異均有統計學意義（t=11.939、5.231、4.049，P<0.05）;T1時刻，與I組比較，I+O組PMW值明顯減小，差異有統計學意義（t=4.214，P<0.05）;T1～T3時刻，與I+R組比較，I+R+O組大鼠PMW值明顯增大，差異均有統計學意義（t=15.384、7.617、5.035，P<0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠術后48 h L4～5脊髓背角磷酸化NR2B表達比較 Western免疫印跡檢測結果顯示，I組術后48 h L4～5脊髓背角磷酸化NR2B表達為（0.37±0.03），C組為（0.06±0.01），I組較C組明顯增加，差異有統計學意義（t=27.727，P<0.05）;I+R組術后48 h L4～5脊髓背角磷酸化NR2B表達為（0.75±0.12），較I組明顯增加，差異有統計學意義（t=8.689，P<0.05）;I+O組術后48 h L4～5脊髓背角磷酸化NR2B表達為（0.28±0.03），較C組明顯增加，差異有統計學意義（t=19.677，P<0.05），I+O組術后48 h L4～5脊髓背角磷酸化NR2B表達較I組明顯減少，差異有統計學意義（t=6.000，P<0.05）;I+R+O組術后48 h L4～5脊髓背角磷酸化NR2B表達為（0.13±0.05），較I+R組明顯減少，差異有統計學意義（t=13.489，P<0.05）。

3 討論

痛覺敏化系指組織或神經損傷導致一定閾下傷害性刺激過強的反應，這一過程與神經膠質細胞密切相關，涉及多種細胞因子、遞質、受體等的表達，在病理性疼痛中具重要作用，可導致疼痛閾值降低，對刺激反應性增強等，影響患者術后恢復[6]。瑞芬太尼是臨床麻醉過程中常用的阿片類藥物，其化學結構中甲酯鍵的存在使其易被體內血液和組織中的假性膽堿酯酶水解，起效快，半衰期短，無蓄積，且無須在肝臟代謝，因而被廣泛用于全身麻醉維持、術后鎮痛及分娩鎮痛[7-8]。但有研究發現，與其他阿片類藥物比較，瑞芬太尼所致的痛覺敏化發生率較高，且發生時間也明顯提前，不僅會導致藥物鎮痛效果降低，還會導致術后切口慢性疼痛，增加患者痛苦及家庭負擔[9]。本研究I+R組PWTL值和PMW值亦明顯低于C組和I組，與以往研究一致，證實了瑞芬太尼會引起切口痛大鼠痛覺敏化，分析瑞芬太尼導致術后疼痛增加的原因可能與手術等傷害性刺激本身所致疼痛及傷害性刺激所致中樞敏化有關。

目前臨床對瑞芬太尼所致痛覺敏化的發生機制尚未完全清楚，有學者認為脊髓背角敏化在痛覺敏化發生過程中具有重要作用[10]。谷氨酸是傷害性刺激致敏的主要神經遞質，中樞神經系統內分布廣泛，通過谷氨酸受體介導可參與中樞神經系統信息傳遞[11-12]。根據激活受體物質不同可分為NMDA受體和非NMDA受體，NMDA受體是興奮性氨基酸受體的主要亞型，有研究發現NMDA受體系統對瑞芬太尼所致痛覺敏化的調控具有重要作用[13]。天然的NMDA受體由NR1、NR2、NR3亞基組成，其中NR2B是最重要的調節亞基，研究NR2B可較好地反映NMDA受體的變化[14]。

羥考酮是一種半合成的μ、κ雙受體激動劑，作用于中樞神經刺痛及平滑肌，跨膜效應及透過血腦屏障作用突出，藥效較強，且對μ受體的親和力較低，呼吸抑制作用較弱，血流動力學穩定，可在體內維持較長時間、穩定的藥物濃度，在增強術后鎮痛效果的同時不會增加不良反應的發生[15-16]。此外，還有研究發現羥考酮具有較強的抗傷害性刺激作用，可減少麻醉劑及阿片類藥物的用量及副作用[17]。本研究采用經典又簡單易建立的大鼠切口痛模型，保證實驗的可行性與結果的可靠性，結果發現皮下注射羥考酮可緩解瑞芬太尼所致術后24 h內切口周圍組織PWTL值降低和術后48 h內PMW值的降低，可預防瑞芬太尼所致的切口周圍組織的痛覺敏化。已有較多研究發現NMDA受體在瑞芬太尼所致痛覺敏化中有重要作用[18-19]。Pergolizzi等[20]研究發現羥考酮可抑制NMDA受體介導的低強度突觸后電位及高強度突觸后電位的作用，抑制A和C初級傳入纖維介導的突觸傳遞，從而發揮抗傷害性刺激效果。因此推測本研究羥考酮可能也是通過抑制瑞芬太尼所致NMDA受體介導的突觸后電位，而發揮預防切口周圍組織的痛覺敏化的作用。進一步行Western免疫印跡檢測結果顯示術后48 h L4～5脊髓背角磷酸化NR2B表達與行為學觀察結果基本一致。

本研究還發現皮下注射羥考酮可引起術后6 h切口周圍組織PWTL值較切口痛組延長，而對切口痛引起的切口周圍組織術后24、48 h的PWTL值和PMW值無明顯影響，羥考酮消除半衰期為2～3 h，這提示在切口痛痛覺敏化過程中除與脊髓背角磷酸化NR2B有關可能還與其他機制或因子相關，還需進一步研究。

綜上所述，瑞芬太尼可誘發切口痛大鼠痛覺敏化，預先皮下注射羥考酮可有效預防切口痛痛覺敏化，這一作用可能與抑制脊髓背角NMDA受體亞基NR2B磷酸化表達增加有關，臨床可采用NMDA受體拮抗劑預防痛覺敏化。

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（收稿日期：2019-09-19） （本文編輯：周亞杰）