東莞地區老年漢族急性冠脈綜合征患者CYP2C19基因多態性研究及對患者預后影響

葉艮英，梁淑貞，何瑞榮，何淑芬，丁少波

(東莞市人民醫院藥學部，廣東 東莞 523059)

隨著我國老齡化進程加快，老年人多存在多種疾病共存、用藥復雜、用藥量大以及藥動學和藥代學改變，用藥不合理是導致患者治療時或預后發生不良反應的主要原因之一[1]。而細胞色素P450酶系作為肝臟微粒體混合功能酶系統最重要的藥物代謝酶，與多種藥物的代謝失活增效密切聯系[2]。近年來本院收治的冠心病患者顯著增加，其中以急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)為主，筆者通過觀察發現在給與經皮冠狀動脈介入治療(percultaneous coronary interbention，PCI)治療后給予氯吡格雷等雙聯抗血小板方案用于減少術后血栓事件的概率，但小部分患者仍出現缺血事件而再次入院，筆者分析認為可能原因為氯吡格雷抵抗，其發生原因與患者代謝相關酶突變有關，但各地區、種族基因突變大有不同[3-4]，文獻中未見有東莞地區的CYP2C19基因多態性研究，故筆者通過研究東莞地區老年漢族ACS患者CYP2C19基因多態性研究及對患者預后影響，為臨床漢族ACS患者個體化用藥提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月-2017年1月東莞市人民醫院收治老年漢族ACS患者578例作為觀察對象，所有觀察對象均符合中華醫學會心血管病學分會《非ST段抬高型急性冠狀動脈綜合征診斷和治療指南》關于ACS相關診斷標準[5]。納入標準：(1)年齡65～85歲；(2)入組前1個月內未使用其他抗血小板、抗凝藥物及PPIs者；(3) 依從性好，可以按計劃堅持服藥、且配合研究定期隨訪者；(4)無神經精神疾病、有能力充分知情理解研究內容。排除標準：(1)患有嚴重血液系統疾病或有出血傾向；(2)嚴重感染；(3)有氯吡格雷或阿司匹林禁忌證；(4)嚴重肝腎功能不全；(5)惡性腫瘤患者；(6)妊娠期、哺乳期婦女。采用焦磷酸測序技術檢測入組患者CYP2C19基因型，并根據不同的代謝型分組。本研究經本院醫學倫理委員會審批。

1.2 CYP2C19基因檢測方法

1.2.1 主要儀器與試劑 焦磷酸測序儀Q24 MDx(德國凱杰公司)；5810R冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；ETC811型PCR儀(蘇州東勝興業科學儀器有限公司)。全血基因組DNA提取試劑盒(長沙三濟生物科技有限公司)；激活劑F(Haemoscope公司)；ADP(規格：2 μmol/L，Haemoscope公司)；AA(規格：1 μmol/L， Haemoscope公司)。

1.2.2 基因組提取 患者入組當日或次日以EDTA采血管采集靜脈血5 mL，24 h內送東莞市人民醫院PCR實驗室，血樣采集后于4 h內完成DNA提取[6]。吸取全血250 μL于1.5 mL EP管中，采用全血基因組 DNA 提取試劑盒提取 DNA按照試劑說明書操作[7]。提取結束后加入預熱到 65 ℃的洗出液 50 μL 洗脫液或dd H2O洗脫，-20 ℃保存待用。

1.2.3 PCR擴增、反應分析 用在線NCBI和 PyroMark Assay Design 2.0 軟件共同設計用于CYP2C19不同基因型上下游引物，用PrimerSTAT 高保真酶進行PCR擴增[8]，將PCR產物進行測序按照試劑及儀器說明使用焦磷酸測序儀檢測CYP2C19基因型。

1.2.4 基因型和代謝表型判定CYP2C19*1位于第636位和第681位均為發生突變則為野生型，CYP2C19*2位于681位堿基G→A，CYP2C19*3位于636位堿基G→A。其中636GG,681GG即*1/*1為廣泛代謝型；636GG,681GA即*1/*2和636GA,681GG即*1/*3為中間代謝型；而636GG，681AA即*2/*2、636GA，681GA即 *2/*3和636AA，681GG 即*3/*3共為弱代謝型。

1.3 隨訪及相關數據收集

收集所有觀察對象的性別、病史、吸煙史、糖尿病史、高血壓史等一般臨床資料，隨訪期為12個月，出院后1個月、3個月、6個月及12個月定期隨訪，隨訪方式有門診復診、再住院或電話隨訪，收集隨訪期間發生的心血管不良事件[9]，并根據患者CYP2C19基因的代謝型不同進行分組分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 東莞市老年漢族人群CYP2C19相關等位基因頻率分布

本研究納入樣品共578例，CYP2C19*1,*2,*3基因頻率分別是62.63%,30.11%和7.27%，其中不同性別中的各等位基因評率如表1所示，不同性別中，CYP2C19*1,*2,*3基因頻率比較差異無統計學意義(χ2=1.177，P=0.555)。

2.2 東莞市老年漢族ACS患者CYP2C19相關基因型及代謝型分布

東莞市老年漢族ACS患者CYP2C19相關基因型頻率為*1/*1占227例(39.28%)、*1/*2占224例(38.76%)、*1/*3占46例(7.96%)、*2/*2占49例(8.48%)、*2/*3占26例(4.50%)、*3/*3占6例(1.04%)，如表3所示，符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(χ2=1.484，P=0.953)，本研究所選研究對象具有群體代表性，處于平衡狀態，如表2所示。

東莞市老年漢族ACS患者CYP2C19相關代謝型頻率為廣泛代謝型占227例(39.28%)、中間代謝型占27例(46.72%)、弱代謝型占81例(14.02%)，如表4所示。

2.3 不同CYP2C19等位基因代謝型的ACS患者預后比較

不同代謝型的ACS患者臨床一般資料比較如表5所示，3組患者性別比例、年齡、冠心病史、糖尿病、高血壓等項目比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

3種代謝型ACS患者除血管性死亡例數差異無統計學意義(P>0.05)外，隨訪期間發生腦梗死、心絞痛復發入院、輕度出血、血小板減少、再次靶血管重建等心血管不良事件發生率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，如表6所示。

隨訪期間，共有59例患者發生臨床終點事件，其中急性腦梗死23例，急性心肌梗死31例，血管性死亡5例；其中廣泛代謝型、中間代謝型和弱代謝型發生率分別為10.17%(6例)、35.60%(21例)、54.24%(32例)，不同組別間臨床終點事件發生率比較，差異具有統計學意義(χ2= 46.67 ，P=0.000)。

表1 東莞市老年漢族人群CYP2C19相關等位基因頻率Table 1 Frequency of CYP2C19 related alleles in the elderly Han population in Dongguan [n(%)]

表2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗Table 2 Hardy-Weinberg genetic equilibrium test

表3 東莞市老年漢族ACS患者CYP2C19相關基因型分布Table 3 Distribution of CYP2C19-related genotypes in elderly Han ACS patients in Dongguan [n(%)]

表4 東莞市老年漢族ACS患者CYP2C19相關代謝型分布Table 4 Distribution of CYP2C19-related metabotypes in elderly Han ACS patients in Dongguan [n(%)]

表5 3種代謝型ACS患者基線資料比較

Table 5 Comparison of baseline data for three metabolic ACS patients

廣泛代謝型(n=227)中間代謝型(n=270)弱代謝型(n=81)P值性別(男/女,n)133/94151/11950/310.993年齡/a( x±s)65.47±11.2364.11±10.8265.07±9.180.362冠心病史/a( x±s)10.23±5.1011.36±4.2911.00±5.720.070糖尿病[n(%)] 46(20.27)71(26.30) 23(28.40)0.641高脂血癥[n(%)] 146(64.32)163(60.37) 50(61.73)0.996高血壓[n(%)] 187(82.38)240(88.89) 73(90.13)0.972吸煙[n(%)] 37(16.30)53(19.63) 14(17.29)0.955

表6 3種代謝型ACS患者隨訪期間心血管不良事件比較

Table 6 Comparison of cardiovascular adverse events during follow-up of three metabolic ACS patients [n(%)]

廣泛代謝型(n=227)中間代謝型(n=270)弱代謝型(n=81)P值腦梗死3(1.33)11(4.07)9(11.11)0.001 3心絞痛復發39(17.18)67(24.81)40(49.38)0.000 2輕度出血35(15.42)18(6.67)2(2.47)0.001 2血管性死亡1(0.44)3(1.11)2(2.47)0.308 7血小板減少23(10.14)6(2.23)0(0)0.000 1再次靶血管重建0(0)3(1.11)7(8.64)0.000 0

3 討論

隨著藥物代謝動力學與基因細胞組學的高度發展，研究藥物代謝差異與基因多態性相關成為近年來的研究熱點[10]。另一方面心血管疾病已經成為威脅我國老齡人口的重要疾病，ACS是導致患者急性猝死的主要類型[11]。PCI術聯合術后藥物預防血栓治療是ACS患者常用治療方式，大量研究發現CYP2C19*1位正常編碼酶活性的等位基因，而*2、*3等位基因的突變可減弱氯吡格雷抑制血小板活性[12]。但CYP2C19酶相關基因在不同人種中差異明顯，具有基因多樣性[13]，且未見有東莞地區漢族老年人群CYP2C19基因多態性的相關研究，而我院心內科收治的患者主要類型為ACS，故針對ACS患者，采用焦磷酸測序檢測患者CYP2C19基因型，為臨床接受氯吡格雷患者的個體化用藥提供依據。

本研究中，東莞地區漢族老年ACS患者 578例中，CYP2C19*1,*2,*3基因頻率分別是62.63%,30.11%和7.27%，CYP2C19相關基因型頻率為*1/*1占39.28%、*1/*2占38.76%、*1/*3占7.96%、*2/*2占8.48%、*2/*3占4.50%、*3/*3占1.04%，而CYP2C19相關代謝型頻率為廣泛代謝型占39.28%、中間代謝型占46.72%、弱代謝型占14.02%，主要集中于快代謝型和中間代謝型為主，而肖旋浩等[14]研究的廣州地區漢族人群CYP2C19基因多態性結果顯示主要為中間代謝型，李潔等[15]研究安徽地區的結果以及范超等[16]研究的重慶地區的結果相似。CYP2C19是細胞色素P450中重要的亞型之一，在多種藥物體內代謝中起著重要作用。研究發現，CYP2C19還可通過抑制白細胞活化黏附、抑制血小板功能和減少細胞黏附因子分泌等影響多種生理活動[17]。而CYP2C19的編碼基因位于第10號染色體上，其中位于外顯子5 上 681位堿基CYP2C19*2和外顯子4上的636位堿基CYP2C19*3突變是影響藥物代謝的重要遺傳因素[18]。當CYP2C19*1突變為CYP2C19*2時，產生一個無功能蛋白，當突變為CYP2C19*3時，產生功能較低的CYP2C19酶，當含有1個或2個突變基因時，可導致CYP2C19酶活性較CYP2C19*1*1基因型降低[19]。

氯吡格雷作為臨床常用的血小板抑制劑，臨床上常與阿司匹林聯用，用于缺血性腦卒中、急性心梗以及PCI術后置入支架患者術后血栓復發的預防方案[20]，其主要作用機制為選擇性抑制二磷酸酰苷與血小板受體結合，進而抑制尤其誘發的糖蛋白GPIIb/IIIa復合物的作用，最終達到抑制血小板抑制的目的[21]。在體外氯吡格雷并無抗血小板作用，口服吸收后可在CYP2C19的作用下氧化水解成活性代謝物，發揮藥效[22]。本研究中弱代謝型患者也占14.02%，而在不同CYP2C19等位基因代謝型的ACS患者預后比較中，3種代謝型ACS患者除血管性死亡例數差異無統計學意義外，腦梗死、心絞痛復發入院、輕度出血、血小板減少、再次靶血管重建等心血管不良事件發生率比較差異明顯。其中廣泛代謝型患者的輕度出血和血小板減少高于中間代謝型和弱代謝型，說明針對廣泛代謝型患者應稍減少藥物用量，以減少該類藥物引起牙齦出血、血小板減少等不良反應。而在腦梗死、心絞痛復發、再次靶血管重建中，弱代謝型患者發生率明顯高于廣泛代謝型和中間代謝型，張鵬博等分析發現攜帶了一個CYP2C19突變型基因的患者，可出現氯吡格雷活性產物轉化率下降，因此導致用藥后血藥濃度不足，而增加ACS患者預后由于血小板抑制功能不足，增加不良心血管疾病發生風險[23]，且在隨訪期間，共有59例患者發生臨床終點事件，其中急性腦梗死23例，急性心肌梗死31例，血管性死亡5例；其中廣泛代謝型、中間代謝型和弱代謝型發生率分別為10.17%、35.60%、54.24%，說明由于基因突變導致的不良心血管事件可危及患者生命，因此，研究老年漢族ACS的CYP2C19基因多態性，并以此指導臨床用藥，盡量避免不合理用藥具有重要意義。

綜上所述，東莞市老年漢族ACS患者中，主要以中間代謝型為主，不同基因亞型的患者預后有所不同，臨床應根據不同CYP2C19基因型給予患者不同的治療方案，減少患者心血管不良事件發生風險。