杜仲健骨方對大鼠骨質疏松癥作用機制研究

邢威,陳雁雁,王樹人,王艷麗,王文姌,張洪財,孫秋

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江護理高等專科學校，黑龍江 哈爾濱 150301； 3.黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040)

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種全身性、骨代謝性骨骼疾病。主要表現為骨組織顯微結構破壞的全身性骨量減少。本病多發于中老年，尤其是絕經期后女性為高發人群，提示本病的發生與雌激素水平密切相關。文獻報道，OP患者群骨脆性增加，加重腕關節、脊柱和髓關節[1-2]骨折風險。隨著社會的進步，人口壽命的增加、結構的改變，人口趨于老齡化，發病率呈上升趨勢，對OP患者的健康構成威脅[3]。骨質疏松癥根據其病因病機以及臨床所表現等可以歸屬于中醫學中的“骨痹”、“骨痿”范疇[4-5]。

根據中醫“腎主骨生髓”、“久病及腎”、“腎虛是骨質疏松癥的病理基礎”等理論，擬定出臨床有效的經驗方杜仲健骨方。杜仲健骨組方：杜仲、淫羊藿、補骨脂、懷牛膝。方解：杜仲、淫羊藿補腎陽、強筋骨，腎陽推動精血運行，共為君藥。補骨脂、懷牛膝溫腎助陽，共為臣藥。諸藥合用，共奏補腎陽、填髓健骨之功效。本課題組前期預實驗證實：大鼠體質量增加與骨礦密度成正相關,能夠降低骨折的風險；子宮指數明顯升高,提示該方可能有類激素樣作用,可預防因卵巢切除或卵巢功能下降。這與此前運用補腎健筋骨法治療骨質疏松癥的報道相符[6-8]。本研究通過測定骨組織Wnt3a、β-catenin基因、蛋白表達，探討杜仲健骨方對大鼠骨質疏松癥的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SD大鼠，體質量(200±20) g，雌性，來源于黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心(GLP)，生產許可證號：SCXK(黑)2018-007。適應性飼養1周。

1.2 藥品與試劑

杜仲健骨方：杜仲35 g、淫羊藿25 g、補骨脂15 g、懷牛膝15 g組成，均由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥局提供，并由黑龍江中醫藥大學藥學院孫慧峰教授鑒定為正品；阿侖膦酸鈉片(揚子江藥業集團提供，國藥準字：H20065637，產品批號：190124)；血清堿性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、骨鈣素(OC)和I型原膠原N-端前肽(PINP)測定試劑盒(上海哈研生物科技有限公司，產品批號：201903)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司)；裂解液 RL、RIPA 裂解液(北京百泰克生物科技有限公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海康朗生物科技有限公司)；PVDF膜(英國Whatman)；抗體及上、下游引物(美國Invitrogen公司)。

1.3 主要儀器

Bio-Rad iQ5實時熒光定量PCR儀(美國伯樂)、Western blot電泳槽、垂直電泳系統(美國 Bio-Rad公司)；KHW-S-8數顯恒溫水浴鍋(杭州億捷科技有限公司)；Varioskan LUX多功能酶標儀(美國 Thermo公司)；MEDIX90雙能X線測量儀(法國Medlnk公司)。

2 方法

2.1 模型的制備與分組給藥

按照文獻[9-11]方法并略加改進制備大鼠骨質疏松癥模型，取3%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)腹腔注射，待大鼠麻醉后，在劍突下剪毛(面積約4 cm×3 cm)；用75%(φ)酒精對手術部位進行消毒，于劍突下1.5 cm處，沿腹白線做縱向切口(約2 cm)，暴露腹腔。尋找腎臟后下脂肪團，提出卵巢，結扎輸卵管及血管。去卵巢組完整摘除雙側卵巢；假手術組取出卵巢周圍等量脂肪組織。最后羊腸線逐層縫合。云南白藥處理外傷，肌肉注射20萬U青霉素，防感染，連續5 d。術后8周，隨機選取10只麻醉，取右側股骨，雙能X線骨密度測量儀檢測造模情況。造模成功后，隨機分成6組：杜仲健骨方高中低劑量、阿侖膦酸鈉(陽性藥組)、模型組、假手術組。各組大鼠(除假手術組)灌胃給藥56 d，末次給藥后，股動脈采血。

2.2 骨密度檢測

將右側股骨剔除軟組織，雙能X線骨密度測定儀測定骨密度值，小動物BMD測試軟件分析。

2.3 血清ALP、TRAP、OC和PINP測定

大鼠經腹腔麻醉，主動脈采血5 mL，室溫靜置1 h后， 3 000 r/min，離心10 min，收集上清液，分裝到EP管中，采用酶聯免疫測試方法(ELISA)檢測血清ALP、TRAP、OC和PINP含量。

2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測骨組織Wnt3a、β-catenin mRNA表達

取右側股骨組織，按10～20 mg加入400 μL 裂解液 RL抽提骨組織總RNA,采用紫外分光光度計測定樣品吸光值(設定波長260和280 nm)，A260/280在1.8～2.0范圍內符合要求，計算RNA質量。引物序列設計，由哈爾濱維科生物科技有限公司合成(見表1)，取3 μg總RNA，用逆轉錄試劑盒逆轉錄后PCR反應檢測β-catenin mRNA、反應條件：45 ℃ 30 min；90 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s；50 ℃ 45 s，40個循環。

表1 引物及探針序列Table 1 Primer and probe sequences

2.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)法檢測骨組織Wnt3a、 β-catenin 蛋白表達

將左側股骨用液氮研磨至粉末狀，加入細胞裂解液，震蕩使組織充分裂解，4 000 r/min 離心10 min，得骨組織蛋白，經 BCA 法測定蛋白濃度。40 μg 蛋白上樣到 20%的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠，進行電泳(濃縮膠為 70 V，0.5 h；分離膠為 110 V，1 h)，分離的蛋白轉膜(80 V，30 min)，使用5%的脫脂奶粉封閉2 h 后，Wnt3a、β-catenin 抗體加入一抗4 ℃孵育過夜，次日1×TBST 洗3次，洗膜后孵育HRP標記的山羊抗兔第二抗體，室溫孵育 1 h，染色，膠片曝光，顯影，定影，軟件測定灰度值。

2.6 數據處理

3 結果

3.1 各組大鼠骨密度的結果

與假手術組比較，模型組骨密度顯著降低(P<0.01); 與模型組比較，杜仲健骨方高、中、低劑量組、陽性藥組骨密度明顯增加(P<0.01或P<0.05)。通過表2結果可見，去除大鼠雙側卵巢建立骨質疏松癥模型成功，陽性藥阿侖膦酸鈉治療效果最好，杜仲健骨方治療效果次之。

表2 各組大鼠骨密度值Table 2 Bone mineral density of rats in each group(n=10)

與假手術組比較：##P<0.05； 與模型組比較：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

3.2 各組大鼠血清 ALP、TRAP、OC、PINP測定結果

見表3。與假手術組比較，模型組血清各指標差異有統計學意義(P<0.01，P<0.05)；杜仲健骨方高、中、低劑量組、陽性藥組大鼠血清中 ALP 、TRAP、PINP、OC含量與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01，P<0.05)。

3.4 各組骨組織Wnt3a、β-catenin 蛋白表達

與假手術組比較，模型組大鼠骨組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平降低(P<0.05，P<0.01)。 各給藥組與模型組比較Wnt3a、β-catenin 蛋白表達水平升高(P<0.05，P<0.01)。見表 4、圖1。

3.3 各組骨組織Wnt3a、β-catenin mRNA的表達

結果見表5。與假手術組比較，模型組各指標差異有統計學意義(P<0.01)；杜仲健骨方高、中、低劑量組、陽性藥組的Wnt3a 、β-cateninm RNA表達水平與模型組比較差異均有統計學意義(P<0.01，P<0.05)。

表3 各組大鼠ALP、TRAP、OC、PINP結果Table 3 Results of ALP,TRAP,OC and PINP in each group

與假手術組比較：##P<0.01； 與模型組比較：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

表4 各組骨組織Wnt3a、β-catenin 蛋白表達水平Table 5 Expression of Wnt3a and β-catenin protein in bone tissue

與假手術組比較：#P<0.05,，##P<0.01； 與模型組比較：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

表5 骨組織Wnt3a、β-catenin mRNA的表達水平Table 4 Expression of Wnt3a and β-catenin mRNA in bone tissue

與假手術組比較：##P<0.01； 與模型組比較：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

A.假手術組； B.模型組； C.杜仲健骨方低劑量； D.杜仲健骨方中劑量； E.杜仲健骨方高劑量； F.陽性藥組。

圖1 各組骨組織Wnt3a、β-catenin 蛋白的表達

Figure 1 Expression of Wnt3a andβ-catenin protein in bone tissue

4 討論

中醫學古典文獻里沒有“骨質疏松癥”的記載，現代中醫學者將其歸為“骨枯”、“骨痿”的范疇，腎虛是其根本病因[12]。大多群體為老年人及絕經后婦女，癥狀為四肢酸軟、骨折、腰背疼痛等。臨床中常用雙膦酸鹽類、雌激素類、降鈣素類藥物，這些藥物治療效果一般[13-14]。因此，尋找安全有效低毒藥物成為迫切需求。本人根據多年臨床經驗，擬定的驗方杜仲健骨方，符合中醫藥“補腎健骨”理論，臨床療效顯著，且不良反應少。為闡明該方劑的作用機制，本實驗考察大鼠血清ALP、TRAP、OC和I型原膠原N-端前肽(PINP)含量，檢測骨組織Wnt3a、β-catenin mRNA和蛋白表達情況，為中醫藥臨床治療骨質疏松癥提供理論依據。

骨密度(BMD)是診斷骨質疏松癥公認的“金標準”。 本實驗檢測各組大鼠股骨骨密度，發現模型組與假手術組比較顯著降低(P<0.01)，說明復制骨質疏松癥模型成功，給藥后骨密度值顯著提高。模型大鼠血清TRAP含量升高、ALP含量降低，表明骨代謝狀態異常。給藥后，杜仲健骨方中、低劑量組與模型組比較有顯著差異(P<0.05)，杜仲健骨方高劑量組與模型組比較有極顯著差異(P<0.01)，證實了該方劑能夠促進骨形成。

Wnt是2個基因 Wg(wingless)和Int的合稱。Wnt 蛋白由19種蛋白組成，包括 Wnt1、Wnt3a、Wnt7b等[15]。最早發現于果蠅和脊椎動物體中。都參與胚胎、器官的發生，具有同源性。Wnt信號通路對細胞分化、增殖和凋亡過程具有調節作用，影響細胞生命進程[16]。在阻斷劑和誘導劑的影響下，Wnt信號通路能夠影響骨髓間充質干細胞定向成骨分化的能力，同時調節破骨細胞、成骨細胞的平衡過程。Wnt信號通路在骨重建過程中起調節作用，是骨質疏松重要病理基礎[17-19]。骨形成的關鍵調節因子為β-catenin，其表達水平和骨形成呈正相關。在Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin發揮了重要作用，其在胞質中積累繼而向胞核的轉位，被認為是該信號通路被激活的標志[20]。β-catenin表達水平降低使血清ALP增加，骨密度降低導致骨質疏松癥發生[21-22]。本實驗結果表明杜仲健骨方各劑量組均能提高大鼠骨組織Wnt3a mRNA和蛋白表達水平。杜仲健骨方高、中劑量組均能提高大鼠骨組織β-catenin mRNA和蛋白表達水平。杜仲健骨方劑量組與模型組比較Wnt3a、β-catenin 蛋白表達水平升高，說明該方劑是通過Wnt/β-catenin信號通路來發揮治療骨質疏松癥的作用，作用機制有待深入研究。