女貞子醇提物對雄激素性脫發模型小鼠毛發生長的影響

劉小赟，吳小詩，潘敬靈，梁玉婷，唐春萍，沈志濱,2,3

(1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術研究中心，廣東 廣州 510006； 3.廣東省化妝品工程技術研究中心，廣東 廣州 510006)

雄激素性脫發(androgenetic alopecia,AGA)，又稱為脂溢性脫發，是一種最常見的脫發類型[1]。近年來，隨著生活節奏加快與壓力的增加，AGA的患病率也逐漸升高，且向年輕化發展。非那雄胺(finasteride)和米諾地爾(minoxidil)是現代臨床常用于治療AGA的藥物，具有較顯著的治療效果，但與此同時具有較多的不良反應和副作用[2-3]。

女貞子是木犀科女貞屬植物(LigustrumlucidumAit.)女貞果實，性涼、味干、微苦，歸肝、腎經，具有明目烏發、滋補肝腎功效，常用于治療肝腎陰虛、眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發早白等病證[4]。目前國內外學者對女貞子的研究主要集中在抗骨質疏松、抗癌、抗衰老、免疫調節等作用[5-6]，但女貞子醇提物對雄激素所致脫發的促毛發生長作用研究還未見報道。本文通過女貞子醇提物對模型小鼠毛發生長的影響評價其促毛發生長作用，并初步探討其作用機制，為女貞子在預防和治療脫發藥物的進一步研究提供有價值的理論參考依據。

1 材料

1.1 主要儀器

Epoch型酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；UV 2301-II紫外分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)；BA310-T型生物顯微(麥克奧迪實業集團有限公司)；JJ-12J型脫水機(武漢俊杰電子有限公司)；JB-P5型包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；RM2016型病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；JB-L5型凍臺(武漢俊杰電子有限公司)；KD-P型組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)；GFL-230型烤箱(天津市萊玻瑞儀器設備有限公司)；KH-IⅡ型全自動研磨儀(武漢塞維爾生物科技有限公司)；TGL-16型高速低溫離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.2 主要藥品與試劑

女貞子(果)購買于廣州同仁堂藥業；二氫睪酮ELISA試劑盒(武漢優爾生科技股份有限公司，批號 L190809514)；雌二醇ELISA試劑盒(武漢優爾生科技股份有限公司，批號 L190923228)；睪酮ELISA試劑盒(武漢優爾生科技股份有限公司，批號 L191014889)；丙酸睪酮(98%，上海麥克林生化科技有限公司，批號 C10232992)；5%米諾地爾酊(廈門美商醫藥有限公司，批號 190715)；睪酮(T，>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號 G1820042)；非那雄胺(>98%，上海麥克林生化科技有限公司，批號 J1810113)；還原性輔酶II(NADPH，>98%，上海麥克林生化科技有限公司，批號 C10526802)；二硫蘇糖醇(DTT，>98%，上海麥克林生化科技有限公司，批號 C10182317)；苯甲基磺酰氟(PMSF，>98%，上海麥克林生化科技有限公司公司，批號 C10090911)；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 實驗動物

C57BL/6小鼠60只，雄性，6周齡，SPF級，體質量 18～25 g，由廣東省動物中心提供，生產許可證號：SCXK(粵)2018-0002。SD大鼠，3只，雄性，9周齡，SPF級，體質量260～280 g，由廣東省動物中心提供，生產許可證號：SCXK(粵)2018-0002。

2 方法

2.1 供試樣品的制備

女貞子醇提物的制備：稱取女貞子干燥粉末20 g，采用95%(φ)乙醇回流提取2次，料液比分別為1∶10、1∶8；提取時間分別為2 h、1.5 h；合并2次濾液，減壓濃縮后，冷凍干燥制成凍干粉，得到女貞子醇提物2.054 g(提取率10.27%)，4 ℃冷藏備用；本文中女貞子醇提物均為95%乙醇提取物。

準確稱取適量女貞子醇提物，采用75%(φ)乙醇溶解，配置濃度為5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的女貞子醇提物溶液，作為促毛發生長作用實驗中女貞子低、中、高劑量組樣品溶液。

準確稱取適量女貞子醇提物，采用75%的乙醇溶解，配置濃度為0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL的女貞子醇提物溶液，作為Ⅱ型5α-還原酶抑制活性待測樣品溶液。

2.2 女貞子醇提物對雄激素性脫發C57BL/6小鼠模型毛發生長的影響

2.2.1 動物分組及給藥方式 米諾地爾是目前臨床常用于治療AGA的外用藥，本實驗采用其作為外用促毛發生長作用實驗的陽性對照。雄性 C57BL/6小鼠60只，適應性飼養1周后，按體質量編號并用Excel軟件根據體質量隨機分為6組，使用脫毛膏在其背部脫除約3×4 cm2，皮膚呈粉紅色且無破損，確認小鼠毛囊處于休止期。參考文獻[7]進行動物造模，除空白組外，各組小鼠背部脫毛區皮膚皮下多點注射丙酸睪酮溶液5 mg/(kg·d)，丙酸睪酮處理30 min后，各組小鼠背部脫毛區域涂抹200 μL的藥物溶液，每天1次，連續35 d。空白組與模型組給予75%乙醇溶液，米諾地爾組給予5%米諾地爾溶液，女貞子低、中、高劑量組給予女貞子醇提物溶液，小鼠給藥劑量分別為1 mg/(只·d)、2 mg/(只·d)、4 mg/(只·d)。

2.2.2 毛發生長狀況觀察 每天觀察各組小鼠脫毛部位皮膚及毛發生長狀況，并記錄每只小鼠脫毛區皮膚顏色由粉紅變成黑色的時間及開始長毛發的時間，評價藥物對小鼠毛發生長周期的影響。給藥0、7、14、21、28、35 d時對每組拍照并記錄毛發生長情況評分結果。評分標準：0分：未生長，脫毛區皮膚呈粉色；1分：脫毛區皮膚呈灰色(小于20%的增長)；2分：脫毛區皮膚呈黑色(大于20%小于40%)；3分：脫毛區皮膚呈黑色并有少許毛發生長(大于40%小于60%的生長)；4分：脫毛區皮膚呈黑色并有部分毛發生長(60%～80%的生長)；5分：脫毛區毛發基本完全生長(80%～100%的生長)[8]。

2.2.3 毛發質量的測定 取血后小鼠脫頸處死，用電動刮毛刀刮取每只小鼠背部脫毛區3×4 cm2面積的毛，用分析天平稱重，求其平均值。

2.2.4 組織學觀察 刮取毛后，在脫毛部位平行于脊椎處取材，將皮膚修剪成1 cm寬的長條狀，置4%(φ)多聚甲醛中固定24～36 h后，沖去多聚甲醛，梯度酒精脫水，石蠟包埋，修塊，切片，最后經HE染色后，置于光學顯微鏡下觀察對比毛囊數量和形態差異。

2.2.5 血清及皮膚組織中激素含量的測定 小鼠過夜禁食，眼球取血，靜置后離心(3 500 r/min，15 min)，收集上層血清；去除小鼠背部毛后，取背部皮膚，稱重并加入冷卻的生理鹽水(1∶10，W/V)進行勻質，在相同條件下離心勻漿液，取上清。按相應試劑盒說明書，用ELISA法測定血清和皮膚勻漿中睪酮(Testosterone，T) 、二氫睪酮(Dihydrotestosterone，DHT) 以及雌二醇( Estradiol，E2)濃度。

2.3 女貞子醇提物對Ⅱ型5α-還原酶的抑制作用

采用體外微量酶反應體系測定其對Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性。非那雄胺為特異性Ⅱ型5α-還原酶抑制劑[9]，臨床常用于口服治療雄激素依賴性疾病，本實驗采用其作為陽性對照。

取雄性SD大鼠3只，禁食不禁水12 h后脫頸處死，取出腹側前列腺及附睪并稱質量，將組織在冰臺上剪碎，用預冷的勻漿液(20 mmol/L磷酸緩沖液，pH 5.5，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF)在玻璃勻漿器中制成1∶5勻漿液(g/mL)，離心后合并上清液得Ⅱ型5α-還原酶。以睪酮為底物，加入Ⅱ型5α-還原酶粗酶和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)組成酶反應體系，體系組成見表1，37 ℃孵育1 h后加入2.5 mL二氯甲烷后終止反應，混勻，離心15 min(5 000 r/min)，取有機層旋干后，加入甲醇溶解定容至1 mL，用0.22 μm 濾膜過濾，采用高效液相色譜法檢測睪酮消耗量。試驗重復3次，每次3個平行樣品。

色譜條件：色譜柱(COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ柱(4.6 mm×250 mm，5 μm))；柱溫為30 ℃；流動相為甲醇-水(70/30，V/V)；流速1 mL/min；進樣量為20 μL；檢測器為紫外檢測器，檢測波長242 nm。

通過色譜測定反應液中睪酮的含量，抑制活性的強弱用抑制率表示，公式如下：

轉化率(%)=受試藥物組睪酮濃度的變化值/空白對照組睪酮濃度的變化值×100%

抑制率(%)=(空白對照組睪酮濃度的變化值-受試藥物組睪酮濃度的變化值)/空白對照組睪酮濃度的變化值×100%

表1 Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性研究反應體系

注：-表示該項未添加。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 女貞子醇提物對雄激素性脫發模型小鼠毛發生長的影響

3.1.1 毛發生長情況 各組小鼠毛發生長情況及毛發質量見表2，毛發生長情況評分見圖1。

與空白組相比，模型組小鼠的皮膚變色時間及長毛時間均明顯延長(P<0.05)，第35天時毛發質量明顯減少(P<0.05)。結果表明皮下注射丙酸睪酮對C57BL/6小鼠的毛發生長具有明顯的抑制作用。與模型組相比，米諾地爾組和女貞子醇提物各組的皮膚變色時間，長毛時間及毛發質量差異均有統計學意義(P<0.05)，說明米諾地爾和女貞子醇提物均在一定程度上能緩解丙酸睪酮對C57BL/6小鼠毛發生長的抑制作用。

表2 各組小鼠的毛發生長情況

組別皮膚變色時間/d皮膚長毛時間/d毛發質量/mg空白組8.5±1.9 13.5±2.2 79.92±7.41 模型組19±2.3*23±2.9*13.97±5.84*米諾地爾組10±0.8#15.6±0.9#51.68±2.12#女貞子低劑量組12.4±2.4#17.0±1.4#32.20±5.48#中劑量組13.2±2.5#16.8±2.3#44.38±3.68#高劑量組15.8±3.3#19.8±3.1#33.76±6.35#

與空白組比較：*P<0.05； 與模型組比較：#P<0.05。

圖1 毛發生長情況評分
Figure 1 Hair growth score

3.1.2 組織學觀察 皮膚橫切面用于測定毛囊數(圖2A-F)。在40倍光學顯微鏡下觀察6個不同區域的毛囊數量，選定區域內空白組小鼠的平均毛囊數為182±5，模型組的為74±9。與空白組相比，模型組毛囊數量明顯降低(P<0.05)，米諾地爾組和女貞子醇提物各組的毛囊數分別為162±22、126±18、154±21和145±22，與模型組相比有顯著增加(P<0.05)。

從皮膚縱切面獲得的毛囊形態如圖3A-F所示，空白組小鼠的毛囊數量多且形態完整，此時毛囊已進入休止期，黑色素形成停止(圖3A)；模型組毛囊形態較短且稀疏，毛囊下端退化，毛乳頭變細，內毛根鞘部分消失，毛發呈桿狀末端(圖3B)；米諾地爾組(圖3C)和女貞子醇提物(圖3D-F)各組毛囊數量較多，毛囊長而大，黑色素形成明顯，由此可知，米諾地爾和女貞子醇提物均能夠改善丙酸睪酮引起的毛囊微型化，維持毛囊正常形態。

A.空白組； B.模型組； C.米諾地爾組； D.女貞子低劑量組； E.女貞子中劑量組； F.女貞子高劑量組。

圖2 女貞子醇提物對毛囊數量的影響(HE染色，40×)

Figure 2 Effect of ethanol extract of Ligustri Lucidi Fructus on hair follicle count (HE staining,40×)

3.1.3 血清及皮膚組織中激素含量 結果見圖4A-H。與空白組比較，模型組小鼠血液和皮膚組織中T和DHT含量均顯著升高(P<0.05)，E2含量差異無統計學意義(P>0.05)，T/E2比值顯著增大(P<0.05)；實驗結果表明該雄激素源性脫發模型小鼠血液和皮膚組織中T和DHT含量升高，性激素平衡狀態改變，模型建立成功。與模型組比較，女貞子醇提物低劑量組血清中T含量顯著降低(P<0.05)，E2和DHT含量差異無統計學意義(P>0.05)，T/E2比值顯著降低(P<0.05)；皮膚組織中的T和DHT含量均顯著降低(P<0.05)，E2含量差異無統計學意義(P>0.05)，T/E2比值顯著降低(P<0.05)；中劑量組與高劑量組血清和皮膚組織中T、DHT含量均顯著性降低(P<0.05)，E2含量差異無統計學意義(P>0.05)，T/E2比值顯著降低(P<0.05)；米諾地爾組的各項激素含量與模型組差異均無統計學意義(P>0.05)。

3.2 女貞子醇提物對Ⅱ型5α-還原酶的抑制作用

配制質量濃度為1.69、3.38、6.76、13.52、27.04、54.08、108.15 μg/mL的睪酮溶液進行液相色譜分析，以濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，制作睪酮標準曲線。睪酮的標準曲線為Y=69 584X-37 693，R2=0.999 9，表明睪酮在1.69～108.15 μg/mL范圍內與峰面積具有良好的線性關系，可以用于含量測定。睪酮標準溶液的液相色譜圖見圖5。

樣品對Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性見表3。與空白對照組相比，女貞子醇提物3個劑量組的睪酮轉化率差異具有統計學意義(P<0.05)，當體外劑量大于1 mg/mL時，可極顯著降低睪酮轉化率(P<0.01)，抑制率可達(81.49±4.03)%，具有明顯抑制Ⅱ型5α-還原酶活性。

A.空白組； B.模型組； C.米諾地爾組； D.女貞子低劑量組； E.女貞子中劑量組； F.女貞子高劑量組。

圖3 女貞子醇提物對毛囊狀態的影響(HE染色，40×)

Figure 3 Effect of ethanol extract of Ligustri Lucidi Fructus on morphology of hair follicle (HE staining,40×)

1.空白組； 2.模型組； 3.米諾地爾組； 4.女貞子低劑量組； 5.女貞子中劑量組； 6.女貞子高劑量組。與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05。

圖4 女貞子醇提物對血清和皮膚中激素水平的影響

Figure 4 Effect of ethanol extract of Ligustri Lucidi Fructus on androgen levels in serum and skin(n=10)

圖5 睪酮標準溶液的液相色譜圖

Figure 5 HPLC chromatogram of testosterone standard solution

表3 女貞子醇提物對Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性

組別劑量/ (mg·mL-1)轉化率/%抑制率/%空白組-29.82±1.62-陽性對照組1 μmol/L 4.83±1.71**84.00±3.89女貞子低劑量組0.5 16.29±0.71*38.93±2.67中劑量組1 5.35±1.73**81.49±4.03高劑量組2 5.14±1.56**80.72±3.13

與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

C57BL/6小鼠動物模型常用于研究毛發生長周期及評估促毛發生長活性，通過對毛發生長周期和皮膚組織切片的觀察，女貞子醇提物各劑量組小鼠毛發質量、毛囊數量顯著增加(P<0.05),證實了女貞子醇提物對雄激素性脫發模型小鼠具有明顯的促毛發生長作用。雄激素性脫發與多種因素有關，其中雄激素及Ⅱ型5α-還原酶在毛發生長中起主要的調節作用[10]，此外頭發毛囊外根鞘中的P450芳香酶將雄激素轉化為雌激素E2，也會抑制毛發的生長[11]。通對血清和皮膚組織中各激素水平的檢測，結果表明女貞子醇提物能明顯降低血清和皮膚組織中雄激素水平(P<0.05)，尤其是皮膚組織中的DHT水平，有效改善雄激素引起的毛發減少和生長緩慢的現象；而米諾地爾對睪酮引起的雄激素水平升高沒有顯著影響，與文獻報道[12]一致，其主要育發作用機制包括擴張頭皮血管，改善微循環和促進毛乳頭細胞中的VEGF和FGF-7的分泌等。各實驗組小鼠血清和皮膚組織中E2含量不具有顯著性差異，當女貞子醇提物生藥濃度為1 mg/mL時，對Ⅱ型5α-還原酶的抑制率可達(81.49±4.03)%。由此可見，在丙酸睪酮誘導產生雄激素性脫發模型小鼠的過程中，Ⅱ型5α-還原酶的活性增高起到至關重要的影響，而P450芳香酶無明顯的影響作用。

有研究表明女貞子可使小鼠觸須毛囊毛乳頭分泌VEGF和HGF增加從而促進毛囊生長[14]，結合本研究結果，女貞子在促毛發生長過程中不僅影響重要的細胞因子，還可以降低雄激素水平，從而起到促進毛發生長，維持毛囊形態的作用，在治療雄激素性脫發中具有一定的優勢，其對頭皮微循環的影響仍在進一步研究中。本研究為女貞子醇提物在預防和治療雄激素性脫發藥物的進一步研發提供了重要的參考價值。