山楂酸對LPS誘導RAW264.7細胞炎癥反應的作用及機制

王樂旬，吳惠娟，張盛昔，韋曲星，胡因銘，郭姣

(廣東藥科大學 廣東省代謝病中西醫結合研究中心/廣東省代謝性疾病中醫藥防治重點實驗室，廣東 廣州510006)

炎癥是一種重要的病理過程，是機體組織對損傷因素作出的防御反應。在炎癥反應及相關疾病發生過程中，巨噬細胞作為主要的參與細胞發揮了重要的作用。在體外實驗中，常以LPS誘導小鼠RAW264.7巨噬細胞作為炎癥細胞模型。LPS可誘導巨噬細胞產生多種炎性細胞因子和趨化因子[1]，均可引起和促進炎癥反應的發生和發展。該細胞模型被廣泛用于研究天然產物、化合物或藥物對炎癥反應的調控及機制[1-2]。

山楂酸(maslinic acid，MA)是一種五環三萜酸，為復方貞術膠囊(FTZ)的重要有效成分，來源于配伍單味藥女貞子中[3]。此外，其還天然存在于包括橄欖等在內的多種植物中[4]。研究顯示，MA具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒和降血糖等多種藥理活性[3-4]。在調控炎癥方面，MA不僅抑制動物模型中炎癥細胞在炎癥組織中的浸潤，還可抑制細胞中炎癥因子的表達[5-7]。但MA在巨噬細胞炎癥反應中的作用及其具體機制仍未明確。

本研究以LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7作為體外炎癥細胞模型，觀察MA對炎癥狀態下細胞內炎癥因子mRNA水平及其蛋白表達的影響，并探討其對AKT、ERK、STAT3和p65等炎癥相關信號通路蛋白的調控，明確MA對炎癥反應的作用及其機制，為其在抗炎的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

MA購自Selleck公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和脂多糖(LPS)為Sigma-Aldrich公司產品；青/鏈霉素、胎牛血清、DMEM低糖培養基(葡萄糖濃度為1 g/L)、HRP標記的羊抗兔和羊抗鼠IgG購自Thermo Fisher Scientific公司；NC膜購自Millipore公司；GAPDH一抗購自ProteinTech公司；p-STAT3、STAT3、p-p65、p65、p-AKT、AKT、p-ERK和ERK抗體購自Cell Signaling Technology公司；ECL發光液購自武漢聚能慧達生物科技有限公司；IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-12和CCL2的ELISA試劑盒購自江蘇酶免實業有限公司；RNAiso-Plus試劑購自Takara公司；逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒為TOYOBO公司產品；蛋白定量試劑盒是武漢博士德生物工程有限公司的產品；Western細胞裂解液和牛血清白蛋白(BSA)為上海碧云天生物技術公司產品。

1.2 細胞

小鼠RAW264.7巨噬細胞，購自中國科學院細胞庫，用含有100 U/mL的青霉素、0.1 mg/mL的鏈霉素和10%(φ)胎牛血清的DMEM于37 ℃，含5%(φ)CO2的培養箱中培養。

1.3 儀器

5810R離心機購自Eppendorf公司；NanoDrop 2000核酸濃度測定儀為Thermo Fisher Scientific公司產品；CLARIO star酶標儀購自德國BMG LabTech公司；LightCycler 480熒光定量PCR儀為Roche公司產品；電泳儀及轉膜儀購自Bio-Rad公司。

1.4 MTT檢測

取處于對數生長期的RAW264.7細胞種于96孔板中，每孔含有1×104個細胞，待細胞貼壁后，加入不同濃度的MA(0、0.625 μmol/L、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L)，培養24 h后，每孔加MTT(PBS稀釋，5 mg/mL)20 μL，然后繼續培養4 h。去上清，加150 μL的DMSO，用移液器吹勻，酶標儀570 nm波長檢測吸光度，根據吸光度進行后續分析。

1.5 細胞處理

將對數期生長期的RAW264.7細胞種于6孔培養板中，每孔1×106個細胞，加入不同濃度的MA預處理12 h后，加入LPS(50 ng/mL)，設置對照組、LPS組、MA5組(5 μmol/L)、MA10組(10 μmol/L)、LPS+MA5組和LPS+MA10組，然后處理8 h或24 h，收集細胞提取mRNA、培養上清或細胞蛋白質進行后續檢測試驗。

1.6 mRNA提取和Q-PCR

mRNA的提取以及Q-PCR過程詳見參考文獻[9]。引物由上海英濰捷基公司合成，序列見表1。

表1 Q-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for Q-PCR

1.7 Western blot

實驗過程參考文獻[9]。將不同處理的細胞利用預冷的PBS洗滌2次后，加入適量的細胞裂解液，吹打混勻，12 000 r/min、4 ℃、離心15 min；取上清，定量，加入適量上樣buffer后100 ℃，煮5 min，行SDS-PAGE電泳；轉膜，5%的BSA封閉，一抗過夜，二抗室溫孵育1 h后，暗房ECL曝光，晾干膠片，掃描分析。

1.8 ELISA

收取不同處理組培養24 h后的上清，按照試劑盒說明書檢測上清中細胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α和CCL2的含量，并進行統計分析。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 MA對細胞增殖的影響

首先利用不同濃度的MA處理RAW264.7細胞，利用MTT檢測細胞增殖情況。結果顯示，在20 μmol/L濃度內，對細胞的增殖沒有影響，40 μmol/L及以上濃度能夠顯著抑制細胞的增殖(P<0.01)(圖1)。據此，選擇5 μmol/L和10 μmol/L 2個不影響細胞增殖的濃度進行后續的實驗。

2.2 MA對LPS誘導的炎癥因子mRNA水平的影響

利用LPS誘導的炎癥細胞模型驗證MA對炎癥的影響，結果如圖2顯示，和對照組相比，LPS處理能夠顯著增加RAW264.7細胞中IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、CCL2和iNOS的mRNA水平(均P<0.01)。和LPS處理相比，MA聯合處理后，能夠顯著抑制LPS誘導的IL-1β、IL-6、IL-12、CCL2和iNOS的mRNA水平的增加(均P<0.01或P<0.05)，且這種抑制具有劑量依賴性。而單獨利用MA處理細胞，沒有對上述炎癥因子的mRNA水平產生明顯的影響。

和對照組(0)比較：**P<0.01。

圖1 MA對細胞增殖的影響

Figure 1 Effect of MA on cell proliferation

2.3 MA對LPS誘導的炎癥因子蛋白水平的影響

通過ELISA方法檢測了培養上清中炎癥因子的水平，結果如圖3所示，和對照組相比，LPS處理能夠顯著刺激巨噬細胞中IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α和CCL2的分泌，使得培養上清中的含量顯著增加(均P<0.01)。和LPS處理組相比，LPS+MA5處理組中的IL-1β和IL-12蛋白水平顯著下降(均P<0.01)，LPS+MA10處理組中IL-1β、IL-6、IL-12和CCL2的蛋白水平顯著下降(均P<0.01)。

2.4 MA對炎癥相關信號通路的影響

結果如圖4所示，和對照組相比，LPS處理能夠顯著增加細胞中p65、STAT3、ERK和AKT的磷酸化水平(均P<0.01)。和LPS組相比，盡管LPS+MA5處理組中的p65、STAT3和AKT的磷酸化水平沒有顯著下降，但都具有下降的趨勢；而LPS+MA10處理組中的p65、STAT3和AKT的磷酸化水平顯著降低(均P<0.05)。而在LPS單獨處理或與MA連用處理中，。ERK的磷酸化沒有明顯的改變。

與對照組比較：##P<0.01； 與LPS組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖2 MA對炎癥因子mRNA水平的影響
Figure 2 Effect of MA on the mRNA levels of inflammatory factors

與對照組比較：##P<0.01； 與LPS組比較：**P<0.01。

圖3 MA對炎癥因子蛋白水平的影響
Figure 3 Effect of MA on the protein levels of inflammatory factors [ρ/(pg·mL-1)]

除了p65和STAT3的磷酸化受到抑制外，單獨MA處理對上述其余蛋白的磷酸化及所有蛋白的總蛋白沒有明顯影響。

3 討論

炎癥是一種基本的病理過程，在多種疾病的發生發展中扮演中重要角色。炎癥也是糖脂代謝性疾病的一個顯著特征，既可由糖脂代謝紊亂引起，也可促進糖脂代謝病的發生和發展，使其成為糖脂代謝性疾病臨床和基礎研究的重要方向[10]。本研究探討了糖脂代謝性疾病治療復方中藥“復方貞術膠囊”中有效成分MA的抗炎作用。研究證實，MA能夠抑制LPS誘導巨噬細胞炎癥因子的表達，機制上是通過抑制p65、STAT3和AKT介導的信號通路實現的。

MA對細胞增殖的不同影響。動物水平上的研究顯示，8 mg/kg，16 mg/kg和32 mg/kg劑量的MA在皮下注射8 d后，并沒有對小鼠的體質量、外周血中T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖產生明顯的影響[11]。本研究在細胞水平上驗證了MA對細胞增殖的影響。和上述結果類似，在20 μmol/L濃度內，MA對RAW246.7細胞的增殖沒有影響，而在40 μmol/L或以上，MA能夠顯著抑制細胞的增殖。所以，本研究選擇了5 μmol/L和10 μmol/L 2個對細胞增殖沒有影響的濃度研究其對炎癥反應的影響。

和對照組比較：##P<0.01； 與LPS組比較：*P<0.05。

圖4 MA對炎癥信號通路相關蛋白水平的影響
Figure 4 Effect of MA on the protein levels of inflammatory signaling pathways

糖脂代謝病的核心病理機制之一是慢性炎癥反應，其治療中藥復方貞術膠囊可能具有抑制炎癥的作用。在動物水平上，本課題組驗證復方貞術膠囊能夠顯著降低糖尿病模型鼠血液中炎癥因子IL-6、CCL2和IL-1β的水平(結果未發表)。這提示復方貞術膠囊中的某些成分具有抑制炎癥反應的作用。有研究顯示，來源于橄欖的MA能夠抑制膠原蛋白抗體所致的關節炎模型鼠關節中炎癥相關因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平[6]以及抑制由LPS和D-半乳糖胺聯合誘導的急性肝損傷模型鼠血液中TNFF-α和IL-6的水平[5]。在細胞水平上，MA能夠抑制LPS刺激的星形膠質細胞中TNF-α和iNOS的mRNA和蛋白質水平的升高[8]以及小鼠腹腔巨噬細胞中TNF-α和IL-6的蛋白質水平的增高[7]。和上述的研究結果類似，本研究證實在體外實驗中，MA能夠抑制LPS誘導的巨噬細胞中IL-1β、IL-6、IL-12和CCL2的mRNA及蛋白質水平的增加。這提示MA是復方貞術膠囊抑制炎癥作用的效應分子之一。

在機制上，有研究顯示MA是通過抑制LPS誘導的p65的活化以及IκB-α的磷酸化來抑制LPS誘導的炎癥因子的表達[6,8]。和上述研究結果類似，本研究證實，MA能夠抑制LPS誘導的p65活化(磷酸化水平增加)。此外，STAT3、ERK和AKT在炎癥反應中也發揮著重要作用[9,12-13]。本研究也證實LPS可誘導ERK、STAT3和AKT的磷酸化水平增加，而MA能夠顯著抑制LPS誘導的STAT3和AKT活化。這表明MA抑制炎癥反應除了與NF-κB通路有關外，還與STAT3和AKT介導的通路有關。

綜上，MA具有抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥作用，其機制可能與抑制p65、STAT3和AKT的活化減少炎性因子表達有關。本研究將為后續MA及其組方藥“復方貞術膠囊”對炎性相關疾病的防治作用研究提供了理論依據和實驗基礎。