HPLC-MS/MS法測定人血清中伏硫西汀的濃度

于志軍，吳海根，林述勝，徐麗莉

(佛山市順德區伍仲珮紀念醫院，廣東 佛山 528300)

伏硫西汀分子式為C18H22N2S，化學名為1-[2-(2，4-二甲基-苯硫基)]苯基哌嗪，是一種多模式作用機制抗抑郁藥物，通過提高腦中5-羥色胺、去甲腎上腺素等神經傳遞功能產生抗抑郁療效[1-4]，可顯著改善認知癥狀，其認知癥狀改善作用獨立于情感癥狀的改善[5]。伏硫西汀口服后吸收緩慢而良好，在7～11 h血藥濃度達峰值，絕對生物利用度為75%，約2周達穩態血藥濃度，食物對其體內藥動學無影響[4]。關于伏硫西汀原料藥、制劑含量測定已有報道[6-7]，但對其血藥濃度與藥動學研究較少，且測定結果易受代謝物與結構類似物干擾。為滿足臨床對伏硫西汀藥動學和治療藥物監測需求，本文采用高效液相質譜聯用技術，用蛋白沉淀法對樣本進行前處理，建立一種簡便、快速測定人血清中伏硫西汀濃度的方法。

1 儀器與試藥

伏硫西汀對照品(批號：1-JSC-75-4，質量分數99.56%，加拿大TRC公司)；伏硫西汀-D8對照品(批號：2-GAC-69-2，質量分數99.1%，加拿大TRC公司)；甲酸銨(質譜純，美國Fisher公司)；甲醇(色譜級，德國Merck公司)；實驗用水(超純水，電阻率=18 MΩ)。

LC-20A高效液相色譜儀、LCMS-8040三重四級桿質譜檢測器均為日本島津公司產品；MS3basic渦旋器(德國 IKA)；SQP-SECURA125-1CN型電子分析天平(德國 Sartorius)；H2050R高速離心機(湖南湘儀儀器有限公司)；超純水純化系統(四川沃特爾設備有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

色譜條件：色譜柱為Shim-pack VP-ODS(2.0 mm×15 cm，5 μm)；流動相為甲醇-5 mmoL/L甲酸銨緩沖溶液(體積比75∶25)；流速為0.4 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為1 μL。

質譜條件：采用電噴霧離子源，正離子掃描模式，脫溶劑管溫度為250 ℃，加熱模塊溫度為400 ℃，干燥氣為氮氣，流速為15.0 L/min。用多反應監測模式，定量分析離子對分別為m/z299.15→m/z150.10(伏硫西汀)、m/z307.25→m/z153.10(伏硫西汀-D8)，碰撞能量分別為22.0、25.0 eV。伏硫西汀及伏硫西汀-D8質譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品工作液的制備 取伏硫西汀對照品適量，精密稱定，以甲醇為溶劑，配制成質量濃度1 mg/mL的對照品儲備液。取對照品儲備液適量，用50%(體積分數，下同)甲醇稀釋得質量濃度分別為20、40、400、800、1 200、1 600、2 000 ng/mL的標準曲線工作液。

圖1 伏硫西汀(A)及內標伏硫西汀-D8(B)質譜圖

Figure 1 Vortioxetine (A) and internal standard Vortioxetine-D8 (B) mass spectrometry

2.2.2 內標工作液的制備 精密稱取內標伏硫西汀-D8對照品適量，以甲醇為溶劑配制成質量濃度1 mg/mL的儲備液，用50%甲醇稀釋得質量濃度為100 ng/mL的內標工作液。

2.2.3 標準曲線和質控樣品的制備 精密量取20、40、400、800、1 200、1 600、2 000 ng/mL的伏硫西汀標準曲線工作液5 μL至2 mL EP管中，加入95 μL空白血清，渦旋30 s，得質量濃度分別為2、4、40、80、120、160、200 ng/mL的伏硫西汀標準曲線樣品。同法制備定量下限和低、中、高質量濃度的血清質控樣品，伏硫西汀的質量濃度分別為2、6、60、150 ng/mL。

2.3 血清樣品處理

取血清樣品100 μL于2 mL EP管中，加入內標工作液20 μL，渦旋15 s，加入沉淀劑乙腈500 μL，渦旋1 min，以14 650 r/min轉速離心5 min，吸取上清液100 μL至進樣瓶。

2.4 專屬性試驗

分別取6份不同來源的未服用過伏硫西汀的正常人空白血清100 μL，不加內標，按“2.3”項血清樣品處理方法處理，按“2.1”項條件進樣分析，得空白樣品色譜圖。另取空白血清3份，分別加入伏硫西汀、伏硫西汀-D8及伏硫西汀+伏硫西汀-D8，按“2.3”項下方法處理，得色譜圖見圖2。可見，伏硫西汀與伏硫西汀-D8的保留時間分別約為1.15 min和1.13 min，血清中內源性物質對目標分析物及其對應內標的測定無干擾，專屬性好。

A.空白血清； B.添加伏硫西汀血清； C.添加內標血清； D.添加伏硫西汀及內標血清。

圖2 專屬性試驗MRM圖
Figure 2 MRM of Specific test

2.5 標準曲線與檢出限

按“2.2.3”項制備標準曲線血清樣品，按“2.1”項條件進樣分析。以分析物質量濃度為橫坐標(x)、峰面積與內標峰面積比為縱坐標(y)，采用加權(1/x2)最小二乘法進行回歸，得到伏硫西汀的標準曲線方程為y=5.61x-1.17×10-3(r2=0.996 8)，定量下限為2 ng/mL，線性范圍為2～200 ng/mL。

2.6 精密度與提取回收率試驗

取“2.2.3”項下定量下限和低、中、高質量濃度(2、6、60、150 ng/mL)的血清質控樣品100 μL，每個質量濃度6份樣品，按“2.3”項血清樣品處理方法處理，按“2.1”項條件進樣分析，求得方法批內精密度和準確度。連續測定3 d，并與隨行標準曲線同時測定，求得方法批間精密度。取低、中、高質量濃度的質控樣品各100 μL，按“2.3”項血清樣品處理方法處理后進樣的峰面積記為A，空白樣品同法處理后、加入相應濃度的對照品溶液進樣后的峰面積記為B，每組每個質量濃度6份樣品，提取回收率=A/B×100%。

按《中國藥典》中“9012生物樣品定量分析方法驗證指導原則”要求計算精密度和準確度，得伏硫西汀的批內精密度為2.61%～4.53%，批間精密度為0.83%～1.97%，準確度為95.48%～103.53%。在低、中、高3種濃度下，伏硫西汀的平均提取回收率為91.93%～97.26%，精密度與回收率均符合方法學驗證要求，結果見表1。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.3”項下低、中、高質量濃度(6、60、150 ng/mL)的血清質控樣品，分別考察在常溫避光放置1 h和24 h、反復凍融1次和3次、-70 ℃凍存1 d和14 d的穩定性。結果表明質控樣品在常溫光照條件下放置24 h、反復凍融3次、-70 ℃凍存7 d和14 d各條件下均穩定，RSD均小于15%，可見血清樣品在各條件下均保持穩定，結果見表2。

表1 血清中伏硫西汀的精密度與回收率試驗結果Table 1 Results of precision and recovery for vortioxetine in serum

表2 樣品穩定性試驗結果Table 2 Results of the stability of the samples (n=3)

2.8 基質效應

分別取6種不同來源的空白血清95 μL，按“2.3”項下血清樣品處理方法處理，得空白基質后，分別加入低、高(含伏硫西汀6、150 ng/mL)質量濃度工作液5 μL與內標溶液20 μL，制備成基質考察樣品，進樣分析，得分析物與內標峰面積比值A1。用去離子水代替血清，同法操作，得分析物與內標峰面比值A2。每份血清樣品每個濃度重復制備2份，計算內標歸一化的基質因子=A1/A2×100%的RSD值。結果伏硫西汀在低、高2個質量濃度水平下的內標歸一化基質因子RSD分別為 9.01%、2.77%，均小于15%，表明該方法無明顯基質影響。

2.9 方法學應用

采用本方法測定13例未知濃度待測含藥血漿樣品，其中1例的質量濃度低于定量下限，12例的質量濃度均在標準曲線濃度范圍內，質量濃度范圍為3.5～33.2 ng/mL，平均質量濃度為16.35 ng/mL，與神經精神藥理學治療藥物監測共識指南(AGNP)[8]推薦的治療濃度范圍(10～40 ng/mL)相一致，表明大部分患者所服用的伏硫西汀達到有效濃度范圍。

3 討論

伏硫西汀作為新型抗抑郁藥，被美國精神病學抑郁癥治療指南、加拿大情緒和焦慮治療網絡成人抑郁癥管理指南和中國抑郁障礙防治指南等推薦為治療抑郁癥的一線藥物，在AGNP指南中伏硫西汀作為2級推薦，臨床需要時可進行治療藥物監測。采用LC-MS/MS測定人血清中藥物濃度的方法有較多的研究[9-10]，但有關伏硫西汀的血藥濃度監測方法文獻報道較少。

本研究旨在建立一種操作簡單、靈敏度高、準確穩定地檢測人血清中伏硫西汀的方法。在色譜條件摸索中發現，隨著甲醇比例增加，響應增強，采用甲醇-水(體積比75∶25)的流動相體系，可減少流動相對儀器的損傷。采用乙腈蛋白沉淀法對樣品進行處理，不但提高了靈敏度，而且有利于改善峰型。本文方法是在文獻[11]方法學條件下進行了優化，緩沖溶液中甲酸銨濃度由原來2×104mmoL/L改成5 mmoL/L，流速由1 mL/min改成0.4 mL/min，結果顯示定量下限可達 2 ng/L，分析時間縮短10 min，且具有更高的回收率(91.93%～97.26%)和更少的進樣量(1 μL)，分離效果良好，可快速對臨床樣品進行高通量定量分析，能夠滿足臨床血藥濃度監測的要求。