甲基綠雙波長吸收光譜法測定面制食品中甜蜜素

劉艷，龐向東，陳明朗，江虹

(長江師范學院 化學化工學院，重慶,408100)

食品添加劑的作用主要在于增強食品營養價值、改善食品感官性狀、抑制食品中微生物的生長繁殖、防止食品腐敗等[1]。隨著食品毒理學研究的不斷深入，人們對某些食品添加劑可能產生的慢性毒性、致畸、致突變及致癌等危害有了新的認識，這些問題引起了人們的廣泛關注[1]。目前，國內外在使用化學制品作為食品添加劑時都非常謹慎。甜蜜素是人工合成的增強甜味功能的食品添加劑，在食品業應用廣泛，但過量使用會對人體造成危害[1]。美國和日本明確規定禁止在食品中添加甜蜜素，而中國、歐盟等國雖然準許添加，但對使用量作了嚴格規定。我國在食品添加劑使用標準(GB 2760—2014 食品安全國家標準)中明確規定，面包和蛋糕中甜蜜素含量不得超過1.6 g/kg，餅干中甜蜜素含量不得超過0.65 g/kg。近年，國內外對甜蜜素的檢測方法主要有高效液相色譜法[2-5]、高效液相色譜-串聯質譜法[6-14]、氣相色譜法[15-17]、氣-質聯用法[18]、電化學法[19-21]及少量分光光度法[22-23]。其中，前4種方法除前處理較麻煩外，日常運行費用較高；電化學法需特殊的電極材料，實驗條件要求較為苛刻。分光光度法因所用儀器價格便宜、操作簡便，有較好的穩定性和重復性，并有較高靈敏度，廣受分析工作者的喜愛。本試驗通過優化反應條件，建立了一種檢測甜蜜素的雙波長可見吸收光譜(dual-wavelength visible absorption spectroscopy, DWO-VIS)技術，用于面制食品中甜蜜素的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為桃酥餅干(1#)、甜薄脆餅干(2#)、老面包(3#)、無夾心面包(4#)，重慶某超市及面包店。

甲基綠(純度99%)，山東西亞化學工業有限公司；甜蜜素(純度99.3%)(GBW(E)100066)，中國食品藥品檢定研究院；HCl(分析純)，重慶川東(化工)集團有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)(分析純)，上海吉至生化科技有限公司；超純水。

1.2 儀器與設備

pHS-3C型酸度計，上海虹益儀器儀表有限公司；EL104型電子天平，上海精密儀器儀表有限公司；U-3010型紫外-可見分光光度計，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液配制

甜蜜素標準溶液：準確稱取0.020 12 g 甜蜜素對照品于小燒杯中，加50 mL 超純水溶解，攪拌，待溶解完全后，轉移至100 mL 容量瓶中，用超純水定容，配成201.2 mg/L儲備液；取儲備液10.00 mL，用水稀釋至100 mL，配成20.12 mg/L 操作液。

甲基綠溶液：準確稱取0.458 5 g甲基綠，用水溶解后定容至1 000 mL,配成1.00×10-3mol/L。

Tris-HCl溶液：將0.10 mol/L HCl溶液和0.20 mol/L Tris溶液混合，用酸度計測定調配成pH 3.2～9.7的系列溶液。

1.3.2 樣品前處理

取適量1#～4# 面包和餅干，分別粉碎、混勻后，準確稱取2 g左右(精確至±0.000 1 g)，加50 mL水，于45 ℃ 熱水浴中攪拌、浸提10 min，再45 ℃ 超聲浸提20 min，過濾，濾液用超純水定容至100 mL。

1.3.3 反應條件優化

1.3.3.1 最適pH值的確定

室溫下，于10 mL 具塞比色管中，加入甜蜜素標準操作液1.00 mL、甲基綠溶液2.00 mL及不同pH的Tris-HCl溶液1.00 mL，用水定容。以試劑空白作參比，掃描吸收光譜，測定616 nm 和652 nm 處的吸光度(A)，作A-pH 曲線，即可判斷反應的最佳pH。同理，在其他條件不變的情況下，考察0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL Tris-HCl溶液在所選定的最佳pH下對吸光度(A)的影響，作A-V最佳pH曲線，即可判斷最佳pH下的最佳用量。

1.3.3.2 甲基綠溶液濃度的測定

室溫下，于10 mL 比色管中加入甜蜜素標準操作液1.00 mL、所選定的最佳pH及用量的Tris-HCl溶液，再加入不同用量(0.50～4.00 mL)的甲基綠溶液，用水定容。按1.3.3.1中的測定方法測定各溶液的吸光度(A)，作A-c(甲基綠)曲線，即可判斷甲基綠的最佳濃度。

1.3.3.3 試劑加入順序

在上述選定條件不變的情況下，改變甜蜜素、Tris-HCl 及甲基綠的加入順序，按1.3.3.1的方法測定溶液的吸光度(A)，依據譜圖上測定波長下吸光度值判斷試劑加入順序對反應靈敏度的影響。

1.3.3.4 反應時間及締合物的穩定性

在上述選定的各項最佳條件下，按1.3.3.1的測定方法測定在5～100 min 內各不同時間下的吸光度，作A-t曲線，即可判斷最佳反應時間及締合物的穩定時間。

1.3.4 標準曲線

準確移取甜蜜素標準溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL 于10 mL 比色管中，加入1.00 mL Tris-HCl(pH 8.84)溶液及2.00 mL 甲基綠溶液，用水定容。20 min后，掃描吸收光譜，根據吸光度(A)及甜蜜素的質量濃度(ρ)即可作A616-ρ、A652-ρ及A616+652-ρ標準曲線。

1.3.5 實際樣品檢測及回收試驗

精密移取1.3.2制得的1#～4# 待測液各2.00 mL，代替1.3.4的甜蜜素標準溶液，并按1.3.4的方法配制溶液，掃描吸收光譜，用靈敏度最高的DWO-VIS(616 nm + 652 nm)法測定吸光度，依據標準曲線或回歸方程即可求得各待測液及原始樣品中甜蜜素的含量(n=5)。同時做3 種加標水平的回收試驗(n=5)，根據回收率和相對標準偏差，即可判斷新方法的準確度和精密度。

2 結果與討論

2.1 甜蜜素與甲基綠的吸收光譜

從圖1-A可知,以水作參比，2.01 mg/L甜蜜素溶液在可見光區的吸收信號十分微弱，而2.00×10-5mol/L的甲基綠溶液(pH 8.84)則有很強的吸收信號，最大吸收峰位于628 nm處。從圖1-B可知,以試劑空白為參比，當在2.00×10-4mol/L甲基綠溶液(pH 8.84)中加入甜蜜素標準溶液后，光譜曲線在570～700 nm 范圍內出現2個較強的正吸收峰，分別位于616 nm(藍移12 nm)和652 nm(紅移24 nm)，由此說明，甜蜜素與甲基綠之間發生反應生成了新物質，并產生具有2個較強吸收峰的新吸收曲線。在616 nm 和652 nm波長處，隨著甜蜜素濃度的增大，新物質的吸光度隨之增大，甜蜜素標準操作液的用量在0.00～1.40 mL 范圍內，服從朗伯-比爾定律。故616 nm 和652 nm 均可選作單波長法的測定波長，對甜蜜素進行定量分析。若在616 nm 和652 nm 處用DWO-VIS 法測定甜蜜素，它仍服從朗伯-比爾定律(因吸光度具有加和性)，且可提高方法的靈敏度,DWO-VIS 法的靈敏度約為單波長法的2倍。故實驗選用DWO-VIS法定量分析甜蜜素的含量。

A-甜蜜素溶液與甲基綠溶液;B-不同濃度甜蜜素溶液與甲基綠混合溶液

2.2 反應條件的選擇

2.2.1 最適pH值的確定

圖2表明，在616 nm 和652 nm 下，pH<7時，體系的吸光度很低，說明此條件下，甜蜜素與甲基綠基本不反應或很少反應；在pH>7的條件下，體系的吸光度隨pH值的增大而增大，當增大至pH 8.84時，吸光度達最大，此時反應的靈敏度相對最高，該條件適于甜蜜素與甲基綠進行反應；當pH>8.84時，體系的吸光度隨pH值的增大而降低，說明此條件下不適于甜蜜素與甲基綠的完全反應?？梢姡瑹o論在616 nm 和652 nm處采用單波長法測定還是采用DWO-VIS法測定，反應的最適pH為8.84。繼而考察了選定條件及其他條件不變時，pH 8.84 Tris-HCl溶液用量對吸光度的影響，結果表明，最適用量為1.00 mL。后續實驗采用選定的最佳pH 值及用量。從圖2可知，DWO-VIS法的靈敏度比單波長法高。

圖2 溶液pH對體系吸光度的影響

2.2.2 甲基綠溶液濃度的確定

圖3表明，在616 nm 和652 nm 下，甲基綠溶液用量在0.50～4.00 mL 范圍內，開始時，隨著甲基綠濃度的增大，體系的吸光度隨之增大，表明此時甲基綠用量不足，甜蜜素與甲基綠反應不完全；當甲基綠用量增大到2.00 mL 時，體系吸光度達最大，此時反應的靈敏度最高；之后隨著甲基綠濃度的再增加，體系吸光度隨之下降，說明此時的甲基綠已過量，其自聚作用增強，導致體系的吸光度降低。可見，甲基綠的最適用量為2.00 mL，即最適甲基綠溶液濃度為2.00×10-4mol/L。從圖3可知，DWO-VIS 法的靈敏度比單波長法高。

圖3 甲基綠溶液濃度對體系吸光度的影響

2.2.3 試劑加入順序的選擇

表1表明，在選定的最佳條件下，改變試劑的加入順序，對體系的吸光度基本不影響，即這幾種試劑可以按任何一種順序加入，生成的締合物的吸光度基本一致。后續實驗按任意順序加入各試劑溶液。

表1 試劑加入順序對體系吸光度的影響

2.2.4 反應時間及締合物的穩定性

以616 nm 為例，考察室溫下甜蜜素與甲基綠在5～100 min的反應時間內對締合物吸光度的影響。圖4表明，從反應開始到20 min，隨著反應時間的增加，體系的吸光度隨之增大，表明在這段時間內，甜蜜素與甲基綠的反應不完全；20～80 min 時，體系的吸光度達最大且基本穩定，表明甜蜜素與甲基綠的反應至少需20 min 才能進行完全，生成的締合物的穩定時間可達1 h；80 min 后，隨著反應時間的增加，體系的吸光度逐漸降低，表明80 min 后，締合物不再處于穩定狀態。故實驗應選在締合物的穩定時間段進行測定。

圖4 反應時間對體系吸光度的影響

2.3 甜蜜素的標準曲線及相關參數

按1.3.4的方法配制甜蜜素標準系列溶液，掃描吸收光譜，作A616-ρ、A652-ρ及A616+652-ρ標準曲線，相關參數見表2。由表2可見，DWO-VIS法的靈敏度比單波長法高。故后續實驗用DWO-VIS法進行測定。

2.4 干擾試驗

2.5 樣品分析

精密移取1.3.2制得的1#～4# 待測液各2.00 mL，按1.3.5的方法配制溶液并掃描吸收光譜，依據標準曲線或回歸方程求出各待測液及原始樣品中甜蜜素的含量(n=5)。各樣品做3種加標水平的回收試驗(n=5)。從表3可知，本法測定結果與GB 1886.37—2015法接近，用F 檢驗法和t檢驗法檢驗新方法的測定結果與國標法間有無顯著性差異(置信度P=95%)，結果表明，新方法的精密度和準確度均無顯著性差異，由此判斷新方法準確可靠。

表3 餅干和面包的分析結果及回收試驗(n=5)

3 結論

本文采用甲基綠作探針測定甜蜜素的DWO-VIS法，此方法簡便、快速、靈敏，并有較高的準確度(回收率為97.5%～103%)和精密度(相對標準偏差為1.4%～2.3%)，當置信度為95%時，F檢驗和t檢驗(見表3)表明，新方法的精密度及準確度均無顯著性差異，說明新方法準確可靠。與國標法GB 1886.37—2015《食品安全國家標準 食品添加劑 環己基氨基磺酸鈉(又名甜蜜素)》相比，新方法更環保、低毒、安全。新方法與已報道的分光光度法[22-23]相比，程序更簡便、線性范圍更寬、線性關系更好，靈敏度更高，并有較好的選擇性。該法適于市售餅干及面包中食品添加劑—甜蜜素的批量定量分析。