霉菌毒素的生物脫除方法及機理研究概述

劉瑋，徐曉飛，任杰，楊繼國,2*

1(華南協同創新研究院，廣東 東莞，523808)2(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510641)

霉菌毒素是霉菌的次級代謝產物，目前已知的有400余種，主要由曲霉屬、鐮孢屬和青霉屬真菌產生[1]。對人和動物危害較大的有黃曲霉毒素(Aflatoxin)、赭曲霉毒素(Ochratoxin)、伏馬毒素(Fumonisin)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone)和單端孢霉烯毒素(Trichothecene)等幾類，主要表現在肝臟毒性、腎臟毒性、致癌性、致畸性、致突變和免疫抑制等方面[2-3]。

霉菌毒素對農作物污染范圍廣且不容易在收獲前有效清除[4]，因而研究脫除霉菌毒素的方法十分必要。目前對脫除霉菌毒素的研究，主要分為物理法、化學法和生物法。物理法常用的手段是清洗、吸附、輻射和熱處理，比較新穎的方式有電解水處理、脈沖光束和冷等離子體處理[5]，但這些方法對設備要求高，能源消耗大，脫毒過程會對營養成分造成破壞，一般只適合霉變程度輕且顆粒大的物料?；瘜W法可分為酸、堿處理、氨處理以及強氧化劑處理，利用霉菌毒素在強酸強堿或者氧化環境中結構不穩定，將之破壞，但化學反應降解毒素容易產生各種副產物，且化學試劑殘留會造成二次污染[6]。不同于物理和化學脫毒法，生物法利用各種微生物脫除霉菌毒素，具有反應條件溫和、脫毒能耗小、環境友好、營養物質破壞少、特異性強等優點[7]。

1 生物脫毒

1.1 生物吸附脫毒

微生物或微生物材料與毒素結合形成吸附復合物，再由過濾等方式除去，通常適合于液體物料或者溶液體系。

HASKARD等[8]研究了乳酸菌與黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)在培養基中的結合效果，證明毒素可以被乳酸菌吸附，在4～37 ℃ 和pH 2～10范圍內沒有明顯的解吸現象，但所形成的結合仍是可逆的。此后陸續有報道利用乳酸菌除去小麥中的脫氧雪腐烯醇(deoxynivalenol, DON)、T-2和HT-2等毒素[9]，在食品發酵過程中結合伏馬毒素B1和B2(fumonisin B1, FB1、fumonisin B2, FB2)，并降低其生物利用度和毒性[10]；也可以在牛奶中吸附結合黃曲霉毒素M1(AFM1)[11]，吸附效果在34.0%～78.9%范圍內不等(表1)。研究也證明酵母可以吸附玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)和AFB1、AFM1等多種毒素[12]。CHLEBICZ等[13]研究了12種乳酸菌和6種酵母對霉菌毒素的吸附能力，發現它們對伏馬毒素的吸附能力最強，對DON的吸附最弱。隨后，人們開始從食物中篩選分離不同的菌種進行研究，如利用Kefiri(主要為乳酸菌和醋酸桿菌)對AFB1、ZEA和OTA進行吸附，吸附量為82%～100%，并證明了在胃腸道中比較穩定，不發生解吸[14]；從酸奶中分離的一種副干酪乳酸菌LHZ-1可以吸附脫除DON，且活細胞比滅活細胞效果更好，脫除率達到40.7%[15]。釀酒酵母可以在5 min內去除葡萄汁中90%的OTA[16]。相同條件下，幾種乳桿菌與酵母對ZEA的吸附效果進行了比較，吸附效率最佳菌種為巴氏乳桿菌(53.3%)和釀酒酵母(36.5%)[17]。此外，研究者們不僅關注微生物與毒素的吸附率，還借助先進的設備觀察與毒素的結合位點。副干酪乳桿菌可以與AFB1特異結合，在掃描電鏡下觀察到其細胞壁表面空間結構發生變化[18]，在胃腸道環境下觀察酵母與OTA的結合比在培養基中更加穩定[19]。利用激光共聚焦顯微鏡觀察發現植物乳桿菌與伏馬毒素的官能團結合，與FB1的結合最有效[20]，吸附部位為細胞壁上的多糖和蛋白。酵母葡甘露聚糖和β-葡聚糖也可以有效地減輕黃曲霉毒素的毒性，基本消除飼料中毒素對肉雞免疫功能和肝腎功能的不良影響[21]。此外，雙歧桿菌屬的微生物和芽孢桿菌等也可以通過生物吸附脫除AFB1、AFM1、OTA等霉菌毒素[22-24](表1)。

表1 各種微生物對霉菌毒素的吸附作用

注：* 樣品為被霉菌毒素污染的小麥，不同批次間含量相差較大，吸附率為平均值。其余樣品與毒素的吸附過程均在PBS溶液或液體培養基中進行

1.2 生物降解脫毒

降解是生物法脫除霉菌毒素最重要的一個方面，利用微生物或酶對毒素特異性降解，得到無毒或低毒的降解產物。微生物分泌的酶多種多樣，對各種毒素降解方式也不相同，涉及到乙酰化、糖基化、開環、脫羧等反應[1]。

酵母不僅可以吸附AFB1，也可對其進行降解，尤其與枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌混合發酵可減少85%以上的AFB1(68.55 ng/mL)[25]。魚腸道中分離的一株枯草芽孢桿菌，可以降解81.5%的AFB1(100 ng/mL)，還能降解AFM1和AFG1[26],但降解產物復雜。最近研究發現，紅球菌[27]和擬香味菌[28]都可以有效地對黃曲霉毒素進行降解(表2)。

由于產物多樣，關于黃曲霉毒素的降解機理研究大多為推測。其中，假蜜環菌被發現可以分泌氧化酶降解AFB1結構中的雙呋喃環，通過薄層層析和動物實驗證明了經過酶處理后的AFB1被完全降解且毒性降低(圖1)[29]。

表2 各種微生物降解霉菌毒素的效果

圖1 假密環菌降解AFB1中雙呋喃環脫毒

ALBERTS等[30]研究了54株真菌對黃曲霉毒素B1的降解作用，發現培養基中漆酶活性與AFB1降解率呈現顯著相關，最佳條件下隔孢伏革菌SCC0152可以降解52.36%的AFB1(1.4 μg/mL)，利用鼠傷寒沙門氏菌進行致突變毒性研究，證明降解產物的毒性明顯小于AFB1。黑曲霉、根霉以及不產生AFs的黃曲霉對于AFB1的降解結果表明，它們通過還原AFB1的酮羰基或雙呋喃環上的雙鍵進行解毒[31](圖2)。

圖2 部分真菌降解AFB1的產物

此外，多種微生物可以降解ZEA。從瘤胃中分離的1株假單胞菌THN1可以將ZEA(2 μg/mL)作為唯一碳源完全降解利用[32]；芽孢桿菌在LB培養基中發酵3 d后可以完全降解濃度為7.45 μg/mL的ZEA[33]，且后續報道的地衣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌對ZEA的降解率均高于85%[34-35](表2)；而乳酸菌降解ZEA(1 μg/mL)最高效率僅為47.8%且過程較為緩慢，達到45%的降解率需要48 h以上[36]。一些研究推測了降解ZEA的途徑，如酵母和假絲酵母可以將之還原為玉米赤霉烯醇(zearalenol, ZEL)[37]；絲孢酵母對ZEA進行脫羧處理，使之不再具有雌激素類似結構從而消除毒性(圖3)[38]。納豆芽孢桿菌降解ZEA的途徑如圖3所示，先將ZEA中羰基位置氧化成內酯環，然后通過水解改變其雌激素類似結構，達到脫毒效果[39]。ZEA也可以通過糖基化、磺酸化等方式降低毒性，但是根據動物實驗顯示，這些結構在腸道中會重新水解還原成ZEA，因此不能夠認為是有效的脫毒手段[40]。

圖3 部分微生物對 ZEA的降解途徑

伏馬毒素是一類具有長鏈氨基酸骨架的二酯，它的降解是經過羧酸酯酶和氨基轉移酶等多步水解完成的[13]。黑色酵母、棘狀霉菌等都可以通過水解酯鍵降解伏馬毒素B1(FB1)[41]。最近發現，從蘑菇堆肥中分離出的混合菌種，其中假單胞菌占主要成分，可以對培養基中伏馬毒素B1(10 μg/mL)進行完全降解，采用液相色譜飛行時間質譜對代謝產物進行鑒定，并通過細胞實驗證明了降解產物是一種低毒的物質[42](見圖4)，通過羧酸酯酶脫去2個分子的己三酸生成部分水解伏馬毒素B1(hydrolyzed fumonisin B1, HFB1)，再通過轉氨酶作用脫去氨基，形成低毒性的降解產物2-酮-HFB1。

圖4 假單胞菌降解伏馬毒素B1的途徑

根霉和毛霉等真菌能夠將液體培養基中的OTA降解到一個極低的水平，紅球菌和短桿菌等也能夠降解90%以上的OTA，但需要5～10 d[43-44]。從動物腸道分離出一些厭氧微生物可以快速降解OTA，在39 ℃條件下24 h內即可降解75%以上的OTA(0.1～1 μg/mL)，尤其是真細菌屬微生物可以在6 h內降解95%的OTA(0.2 μg/mL)[45]。有學者證明水解OTA中的內酯環可達到降低毒性的效果[24](圖5)。

圖5 微生物對OTA的兩種主要降解途徑

從貯藏玉米中分離出1株芽孢桿菌可以通過另一種方式降解OTA，經實驗證明其分泌的羧肽酶對OTA中的肽鍵進行了水解，生成低毒的代謝產物OT-α(圖5)[46]。此外，小片球菌、黑曲霉、不動桿菌等分泌的羧肽酶A、蛋白酶A、脂肪酶和OTA酶等胞外酶和酵母分泌的胞內酶都通過此途徑降解OTA，且被認為是最有效的降解途徑[47](表2)。

單端孢霉烯類毒素的主要毒性結構在于環氧結構和特殊位置的羥基或乙?；?，因此，去環氧化、去乙酰化或者糖基化是微生物脫毒方式[48]。GAO等從雞腸道中分離出1株細菌，以脫氧雪腐烯醇為底物時可以氧化脫除其分子上的環氧結構，對于T-2毒素、HT-2 和T-2三醇等都具有相似的作用方式[49]。土壤中分離得到的包含梭菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸球菌屬、鏈霉菌屬和單胞菌屬的混合菌種在12～40 ℃、pH 6.0～7.5的條件下可以使DON完全去環氧化[50]。HE等也做了相似的研究，從土壤中分離出的假單胞菌在48 h內完全降解DON(100 μg/mL)生成3-去環氧-DON，同樣也可以將DON或雪腐烯醇(nivalenol, NIV)變為3-酮-DON或3-酮-NIV[51](圖6)；乳酸菌分泌胞外酶通過去環氧化對DON和T-2毒素進行降解，降解率分別為100%和58%[9, 52](表2)。

圖6 單端孢霉烯類毒素的主要降解途徑

由于細菌可分泌多種酶，一些細菌可以同時降解多種毒素。如PETCHKONGKAEW等[53]從發酵黃豆中分離出1株芽孢桿菌可以降解AFB1和OTA。短桿菌屬中有多種細菌可以降解多酚芳環結構,并分泌羧肽酶可以用于降解AFs和OTs[43]；紅球菌可以同時降解AFB1、ZEA和OTA等，與其分泌的內酯水解酶有關[27]。

2 研究展望

生物吸附通過微生物細胞壁上的多糖和蛋白成分對霉菌毒素進行結合，被吸附后的毒素即使經過胃腸道的消化也不易被釋放，但目前針對霉菌毒素釋放的實驗多數為體外模擬，缺乏相應的動物實驗進行效果評價。

生物降解是未來的研究熱點，許多菌種被證明能降解霉菌毒素，但機理與途徑并不清楚，需要進一步探究降解方式、降解產物毒性以及系統的評價方法。另外，生物降解霉菌毒素周期大多在12～60 h，有些發酵降解甚至長達30 d，而降解酶分離純化較為困難，大多數穩定性較差，難以滿足生產過程中快速高效的需求，還需進一步研究其他快速高效降解的方法。

目前的研究主要集中在單株菌降解單一種類霉菌毒素，而農作物污染的霉菌毒素往往不止1種且它們之間具有協同增強毒性的作用，因此對單一毒素的脫除研究并不能很好地滿足實際需求，需要進一步加強對多種霉菌毒素同時進行降解的研究。理論上，生物降解毒素需要一整套完整的酶系才能徹底解毒，通過多菌種的合理復配，優化發酵條件，使分泌的各類酶協同增效、徹底降解同種或多種霉菌毒素也是未來生物降解的發展趨勢。