在線固相萃取-二維色譜快速測定配方奶粉、米粉中維生素D的含量

葉佳明，王京，葉磊海，何斌，仰海青，汪慶旗，陳青俊

1(浙江公正檢驗中心有限公司，浙江 杭州，310009)2(贊宇科技集團股份有限公司，浙江 杭州，310009)

維生素D是固醇類衍生物，主要包括維生素D2(麥角鈣化醇)和維生素D3(膽鈣化醇)，對哺乳動物具有促進鈣磷代謝，抗佝僂病的作用[1-2]，但維生素D攝入過大，也會引起高鈣血癥。因此在嬰幼兒配方奶粉、米粉中，維生素D的添加量需要在一合理的范圍內。但維生素D化學性質不穩定，溫度、光照等條件的變化會導致其氧化分解，在嬰幼兒配方奶粉、米粉等基質中干擾物質較多，維生素D是經包埋后再添加到食品基質中，因此對其準確定量具有較大難度。傳統的分析方法需要皂化破壁、有機溶劑萃取、濃縮、色譜凈化、正相分離、質譜檢測等較多步驟，操作過程較為繁瑣、耗時久，回收率不穩定，導致測定結果重現性不好[3]。

二維液相色譜具有峰容量大、自動化程度高、能夠顯著降低復雜樣品的基質效應等特點，已成為生物復雜樣品的高效分離分析手段，在食品和藥物分析中已得到廣泛的應用[4-12]。張艷海等[13-16]、林玉宙等[3]、戚綠葉等[17-20]采用在線二維液相色譜法同時測定嬰幼兒和成人配方營養品中的維生素A、D3和E，已得到較好的應用，但在進入二維色譜之前需要將皂化液與石油醚進行液液萃取，還需要將有機溶劑進行濃縮后才能分析，前處理較為麻煩。本文采用在線固相萃取結合二維色譜快速測定嬰幼兒配方奶粉、米粉中的維生素D，簡化了前處理的操作步驟，提高了方法的準確性和樣品的處理效率。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

Agilent 1260液相色譜儀，配置SPE泵、一維泵、二維泵、自動進樣器、紫外檢測器、DAD檢測器(配大流通池)、柱溫箱、2個六通閥。SPE柱，一維色譜柱：Aglient Poroshell 120 EC-C8(4.6 mm×100 mm，4 μm)，二維色譜柱：Aglient Eclipse PAH(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)。磁力攪拌器，上海碩光電子科技有限公司。

維生素D2、維生素D3：純度>98%，Dr.Ehrenstorfer。KOH、95%乙醇、抗壞血酸、BHT均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、乙腈、甲醇均為色譜純，美國Fisher公司；去離子水(18.2 MΩ·cm),Mil-lipore 純水機制得。

1.2 樣品預處理

奶粉樣品：稱取5 g樣品于250 mL圓底燒瓶中，加入10 mL溫水，渦旋1 min，使樣品充分溶解，加入1 g抗壞血酸、0.1 g BHT，25 mL無水乙醇和5 mL 500 g/L KOH水溶液，80 ℃皂化30 min，冷卻后，轉移至50 mL容量瓶中，用體積分數為50%乙醇水溶液定容。過0.22 μm濾膜后待測。

米粉樣品：稱取5 g樣品于250 mL圓底燒瓶中，加入10 mL溫水，渦旋1 min，加入0.5 g淀粉酶，60 ℃酶解30 min，余下步驟參照奶粉樣品操作。

1.3 標準溶液配制

準確稱取適量維生素 D2、D3標準品，以無水乙醇溶解并定容至25 mL，使其質量濃度約為100 μg/mL，臨用前，參照GB 5009.82—2016[21]方法對儲備液進行校正，分別吸取1 mL維生素 D2、D3標準儲備液至100 mL棕色容量瓶中，以無水乙醇定容至刻度，混勻。分別用1 cm石英比色皿，以無水乙醇為空白參比，在264 nm波長下測定其吸光度(A)，按公式(1)計算其校正后的濃度(X)，維生素D2、D3的1%比色光系數E分別485和462。

(1)

取上述校準后標準品儲備溶液適量，分別加體積分數為50%乙醇水溶液進行稀釋，制成各標準工作溶液: 0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.20 μg/mL。

1.4 儀器條件

柱溫30 ℃, 進樣量100 μL。SPE泵流動相：A為水B為乙醇，一維分析泵的流動相: A為水,B為乙腈;流速為1.50 mL/min二維分析泵的流動相: A 為乙腈，B為甲醇，流速為0.40 mL/min; 檢測波長: 264 nm; 系統管路如圖1所示。梯度洗脫程序見表1,閥切換時間見表2。

圖1 在線固相萃取二維柱切換系統流路示意圖

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

應用二維色譜測定乳制品中的脂溶性維生素已得到一定的應用[2-3,13-20]，其關鍵技術在于系統流路的構建和色譜條件的確定。林玉宙等[3]、張艷海等[13-16]、戚綠葉等[17-18]均采用二維液相色譜分離的中心切割法，通過一維色譜柱實現初步分離后，將含有維生素D的餾出物切割至二維色譜柱中進行進一步分離，達到凈化的目的，為本文系統流路的構建和色譜條件的確定提供了參考。但其方法樣品溶液在進入二維色譜之前需要先將皂化液與石油醚進行液液萃取，萃取后還需經水洗除雜、脫水、濃縮、定容等步驟才能分析，前處理較為繁瑣，不便于批量操作，有一定的局限性。

表1 SPE、一維系統、二維系統洗脫程序

表2 閥切換時間和位置

本文采用在線固相萃取-二維色譜測定配方奶粉、米粉中維生素D的含量。樣品經過皂化定容后，可直接進樣分析，樣品溶液經在線SPE柱凈化后，通過六通閥轉入在一維色譜柱中，在一維色譜柱實現初步分離后，將維生素D的餾出物轉移至二維色譜柱中進行二次分離(如圖1所示)。為了提高維生素D在SPE柱上的凈化效果，本文考察了甲醇、乙腈和乙醇的淋洗效果，發現甲醇和乙腈對脂溶性物質溶解性更低，洗脫能力較弱，雜質在SPE柱上保留較強，使用甲醇和乙腈作為淋洗溶劑時，在一維色譜中發現雜質更多，最終確定乙醇水作為洗脫溶劑，通過梯度洗脫，先用高水相淋洗除去皂化液中的堿液和大部分水溶性雜質，再用高有機相將目標化合物洗脫下來，通過六通閥進入一維色譜。

一維色譜分離在色譜柱規格選擇上，應選擇高柱效色譜柱，有助于壓縮譜峰，提高分離度，使得峰寬變窄，縮短閥切換時間窗口，減少一維色譜中雜質進入二維色譜。與C18柱相比C8柱出峰更快，因此一維色譜可以選擇對脂溶性物質保留更弱的C8柱，流動相選用乙腈水，可將維生素D2和維生素D3壓縮成一個峰，縮短閥切換時間窗口。為了確定一維色譜準確閥切換時間，可通過進高濃度標準品溶液，先測定維生素D在一維色譜中的出峰時間，為保證樣品中維生素D全部切割至第2個六通閥的捕獲柱中，將時間適當調寬，本實驗通過連續進樣，考察了保留時間波動范圍，確定了最終的切換時間窗口為11.35～11.9 min，閥切換時間和位置見表2。

通過第二個六通閥的捕獲柱可以減少進入二維色譜的溶劑量，避免峰過度展寬，在二維分離體系中應考慮流動相的兼容性，以及一維分離機理和二維分離機理的差異性。因此本文二維色譜采用 Agilent Eclipse PAH(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)色譜柱，該色譜柱以優異的分離性能在生育酚、類胡蘿卜素等脂溶性物質分離中有較好的應用。并以甲醇和乙腈作為流動相可以在短時間內較好分離雜質、維生素D2和維生素D3，滿足檢測要求(如圖2所示)。

圖2 標準品和樣品色譜圖

2.2 方法的線性范圍、儀器定量限、精密度考察

分別吸取適量校準好的維生素D2和D3儲備液，至10 mL棕色量瓶中，制成維生素D系列混合標準品溶液; 結果顯示，維生素D2在0.002～0.20 μg/mL范圍內的相關系數R為0.999 7，維生素D3在0.002～0.20 μg/mL 范圍內的相關系數r為0.999 9，表明各目標物線性關系良好。按S/N=10確定維生素D2和維生素D3的定量限濃度，推算出維生素D2的定量限為0.38 μg/100 g，維生素D3的定量限為0.40 μg/100 g。均小于GB 5009.82—2016[11]第三法中維生素D的定量限(維生素D2定量限3 μg/100 g、維生素D3定量限0.6 μg/100 g)。取 0.05 μg/mL維生素D2、D3的混合標準溶液連續進樣10次，計算得到維生素D2和D3峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.88%和0.92%。結果表明該方法精密度良好。

2.3 回收率

準確稱取 5 g嬰幼兒配方奶粉和配方米粉，分別按5.0、10、20 μg/100 g三種水平添加標準溶液，按照上述實驗方法進行操作，測定維生素D2和維生素D3的含量，計算回收率。表3結果顯示，維生素 D2的加標回收率為91.3%～96.3%，RSD為1.9%～3.9%; 維生素 D3的加標回收率為91.6%～97.2%，RSD為1.6%～3.1%,表明該方法回收率高、穩定性較好。

表3 樣品中維生素D 的含量及其加標回收率(n=6)

注：“ND”表示未檢出

表4 本方法與國標檢測方法樣品檢測結果的偏差 單位：μg/100 g

2.4 實際樣品測定及與標準方法比較

分別采用本法和我國現行標準分析方法(GB 5009.82—2016第三法)對10種嬰幼兒配方奶粉和米粉中維生素D含量進行測定，結果見表4，分別對2組數據進行配對t檢驗，進行了統計學分析，結果表明奶粉樣品t計=0.560，米粉樣品t計=0.381，查T檢驗臨界值表t表(9,0.05)=2.262，P>0.05。t檢驗表明差異無統計學意義，表明2種方法對奶粉和米粉中維生素D的測定結果無顯著性差異。

3 結論

本文建立了在線固相萃取結合二維色譜快速測定嬰幼兒配方奶粉、米粉中維生素D含量的方法。樣品溶液皂化后定容，無需復雜操作，通過儀器自動凈化分析檢測，實現配方奶粉、米粉中維生素D的快速測定。通過本方法檢測得到維生素D的加標回收率為91.3%～97.2%，RSD小于5%，方法定量限為0.40 μg/100 g，滿足檢測要求，并通過配對t檢驗法與標準方法測定結果進行比較分析，測定結果無顯著性差異。本方法操作簡便、快速，自動化程度高，重現性好，方法回收率高，可作為配方奶粉和米粉中維生素D的測定方法推廣應用。在線固相萃取結合二維色譜的預處理模式凈化效果好，操作簡單，也可以為復雜基質中維生素B12、泛酸、生物素等其他低含量維生素的測定提供一種新的思路。