高膽鹽水解酶活性乳酸菌的篩選及其酶活性影響因素研究

劉孝芳，遲珺曦，雷文平,2，劉成國,2*

1(湖南農業大學 食品科技學院，湖南 長沙,410128) 2(食品科學與生物技術湖南省重點實驗室(湖南農業大學)，湖南 長沙,410128)

在日常膳食中，人們會因過量攝入食物而導致血清中膽固醇含量異常，進而增大心腦血管疾病的患病率[1]。乳酸菌具有降膽固醇的功能特性[2-4]，其中乳酸菌所產的膽鹽水解酶(bile salt hydrolase, BSH)在降解機制中發揮著至關重要的作用[5]。BSH能水解胃腸道中的結合態膽鹽(甘氨膽酸鹽)，將其轉變成氨基酸和游離態膽酸，游離態膽酸能與膽固醇共同沉淀，以糞便的形式排出體外，從而降低血清中的膽固醇含量[6]。此現象亦稱“共沉淀現象”[7]，是目前較認可的降解機制[8-9]。

本試驗對產BSH的乳酸菌進行篩選與鑒定，以BSH酶解甘膽酸鈉后的甘氨酸生成量作為BSH活性判定指標，旨在研究產BSH的乳酸菌在不同條件下產BSH酶的活性及氨基酸生成量的變化規律，為進一步優化BSH水解反應條件和深入探討乳酸菌降解膽固醇機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶，湖南省畜牧場牛奶貯藏罐；植物乳桿菌(LactobacillusplantarumWCFS1)，湖南農業大學食品科技學院實驗室提供。

1.1.1 試劑

MRS肉湯固(液)體培養基，廣東環凱微生物科技有限公司；牛膽酸鈉，北京索萊寶科技有限公司；甘膽酸鈉，上海麥克林生化科技有限公司；脫脂奶粉，澳優乳業股份有限公司；CaCO3、NaOH、HCl、NaCl、葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸三鈉、甘油、茚三酮、乙醇、甘氨酸、三氯乙酸(分析純試劑)，國藥集團化學試劑有限公司；革蘭氏染色液，廣東環凱微生物科技有限公司。

茚三酮顯色液：12.5 mL 10 g/L茚三酮檸檬酸溶液(稱取0.5 g茚三酮溶解于50 mL pH 5 0.5 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中)+32.5 mL體積分數30%甘油+5 mL 0.5 mol/L檸檬酸鹽緩沖液

1.2 儀器與設備

HX-20G恒溫金屬浴鍋，上海瀘析實業有限公司；HH-601超級恒溫水浴，常州市萬豐儀器制造有限公司；Bante920 pH計，上海般特儀器制造有限公司；XW-80A漩渦混勻儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；1510全波長酶標儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；TG16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；BH-2光學顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離與純化

取25 mL牛奶置于盛有225 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中(瓶中預置適量的無菌玻璃珠)，充分混勻得10-1的樣品勻液，再稀釋成10-2、10-3、10-4的樣品。分別吸取稀釋液0.1 mL于含10 g/L CaCO3的MRS固體培養基平板上，涂布分離，37 ℃下培養24～48 h[10]。乳酸菌代謝產生的乳酸可溶解CaCO3，在培養基上形成透明的溶鈣圈[11]，挑取有明顯溶鈣圈，且革蘭氏染色為陽性的菌落，于MRS固體培養基上3代劃線純化后，編號并保存備用。

1.3.2 產膽鹽水解酶菌株的篩選

依據乳酸菌降膽固醇的機理[7]：乳酸菌產生的BSH使膽鹽共軛活性增強，將結合態膽鹽水解為游離態膽酸，游離態膽酸與膽固醇共同沉淀。若菌株能夠產BSH，則菌落在含膽鹽培養基中形成乳白色沉淀圈。

將分離純化得到的乳酸菌接種于MRS液體培養基中活化2代，參照王玉文等[12]的牛津杯法將菌懸液接種至含3 g/L?；悄扄}的MRS固體培養基上，接種量為0.15 mL，37 ℃培養72 h后，觀察菌落周圍是否出現乳白色沉淀圈。挑取沉淀，于蒸餾水中完全溶解，旋渦振蕩后滴加茚三酮顯色液，溶液變藍紫色則初步確認存在膽鹽水解酶[13]。

植物乳桿菌WCFS1含4個膽鹽水解酶活性基因[14]，具有高膽鹽水解酶活性，因此以WCFS1作為陽性對照菌株，在篩選及不同條件下BSH的活性測定的試驗中作參比對照。

1.3.3 菌株N1、N12的細胞形態觀察及分子生物學鑒定

對N1和N12進行革蘭氏染色，并在光學顯微鏡下觀察細胞形態。參照吳詩敏等[15]的分子生物學鑒定方法，將液體培養基中的菌株純化得到PCR產物，隨即送至上海生工生物工程有限公司進行測序并構建系統發育樹。

1.3.4 不同條件下膽鹽水解酶的活性測定

BSH是一類由腸道微生物合成的胞內酶，能水解結合型膽鹽從而增強菌體對膽鹽毒性的抵御能力，延長菌體在腸道中的生存時間[16]。BSH特異性識別底物甘膽酸鈉，將其水解生成甘氨酸，試驗中以測定甘氨酸的生成量為判定BSH水解活性的指標。甘氨酸與茚三酮作用生成藍紫色物質[17]，記錄其在570 nm處的吸光值。

1.3.4.1 酶活力的測定及標準曲線的繪制

參照姜金康[18]測定酶活力的部分方法作修改。將培養24 h的發酵液、空白組加入體積分數15%三氯乙酸，添加量為體積分數為30%，混勻靜置15 min，8 000 r/min離心10 min，吸取1 mL上清液，加入0.5 mL茚三酮顯色液，旋渦振蕩，密封沸水浴15 min，迅速冰浴3 min，再加入0.5 mL體積分數95%的乙醇，混勻靜置5 min后測定在570 nm處的吸光度。

配制1 mmol/L甘氨酸標準溶液，準確吸取上述溶液0、200、400、600、800、1 000 μL至離心管中，用蒸餾水補足體積為1 mL，再分別加入0.5 mL顯色液，旋渦振蕩后密封沸水浴15 min，迅速冰浴冷卻3 min，加入0.5 mL體積分數95%的乙醇混勻，靜置5 min，在570 nm下測定吸光度。以吸光度為縱坐標，甘氨酸標準溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.4.2 pH對膽鹽水解酶活性的影響

制備7組不同pH的脫脂牛奶培養基(含3 g/L甘氨膽酸鈉的12%脫脂牛奶)，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將每組培養基pH調節至1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，N1、N12、WCFS1活化2代后，以10%接種于上述培養基中。每組設置空白對照，于37 ℃培養24 h，測定膽鹽水解酶的活性。

1.3.4.3 紫外照射時間對膽鹽水解酶活性的影響

N1、N12、WCFS1活化2代后，以10%接種于脫脂牛奶培養基(含3 g/L甘氨膽酸鈉的體積分數12%脫脂牛奶)中，并分為7組。紫外光(30 W)照射上述培養基0、5、10、15、20、25、30 min，每組設置空白對照，于37 ℃培養24 h，測定膽鹽水解酶活性。

1.3.4.4 溫度對膽鹽水解酶活性的影響

活化2代后的N1、N12、WCFS1以10%接種于脫脂牛奶培養基(含3 g/L甘氨膽酸鈉的12%脫脂牛奶)中，制備5組實驗組于26、37、48、59、70℃下處理30 min，每組設置空白對照，于37 ℃培養24 h，測定膽鹽水解酶活性。

1.3.4.5 糖濃度對膽鹽水解酶活性的影響

制備7組不同葡萄糖濃度的脫脂牛奶培養基(含3 g/L甘氨膽酸鈉的12%脫脂牛奶)，葡萄糖添加量為：1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%。N1、N12、WCFS1活化2代后，以10%接種于以上7組中。每組設置空白對照，于37 ℃培養24 h，測定膽鹽水解酶活性。

1.3.4.6 鹽濃度膽鹽水解酶活性的影響

制備7組脫脂牛奶培養基(含3 g/L甘氨膽酸鈉的12%脫脂牛奶)，NaCl添加量為：1%、4%、7%、10%、13%、16%、19%，N1、N12、WCFS1活化2代后，以10%接種于上述培養基中。每組設置空白對照，于37 ℃培養24 h，測定膽鹽水解酶活性。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌分離與純化的結果

從湖南省畜牧場牛奶中分離得到27株乳酸菌，分離純化后按照挑選順序編號為N1～N27，用40%甘油于-20 ℃冷凍保藏。

2.2 產膽鹽水解酶菌株的篩選

27株乳酸菌中僅有2株產BSH，為菌株N1和N12。圖1是3株菌(包含陽性對照菌WCFS1)在含?；悄扄}的培養基上呈現的乳白色沉淀圈，且3株菌刮下的沉淀溶于蒸餾水后滴加茚三酮顯色劑，均呈藍紫色。

圖1 沉淀圈現象

2.3 菌株N1、N12的細胞形態觀察與分子生物學鑒定

由圖2可知，菌株N1、N12細胞均成桿狀或圓柱形，菌體有平直狀、彎曲狀，細胞兩端呈弧狀，單生、成對、成鏈排列，無芽孢，革蘭氏染色結果為陽性。因此，初步判定2株菌為乳桿菌屬(Lactobacillus)。

圖2 菌株N1和N12的細胞形態

經測序獲得菌株N1、N12的16S rRNA 基因序列，基因序列大小分別為1 449、1 437 bp。測序結果通過BLAST序列對比后，構建菌種系統發育樹，如圖3所示。N1、N12與L.plantarumMG5204、L.plantarumTSGB1272聚于一支。因此，菌株N1和N12為植物乳桿菌(L.plantarum)，結合菌株細胞形態的觀察而進一步確認2株菌均為植物乳桿菌(L.plantarum)。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株N1和N12的系統發育樹

2.4 不同條件下膽鹽水解酶的活性測定

2.4.1 甘氨酸標準曲線的繪制

甘氨酸含量測定標準曲線方程為y=2.685 5x-0.497 5，R2=0.999 2，其中x代表甘氨酸濃度，y代表在570 nm下的吸光值。

2.4.2 pH對膽鹽水解酶活性的影響

為了探究pH對BSH活性影響，本試驗對N1和N12的BSH酶解后的生成物含量(甘氨酸)進行分析，結果如圖4所示。

圖4 pH對酶活性的影響

3株菌(N1、N12和WCFS1)培養上清液中的甘氨酸含量隨著pH值的上升，先增加后減少，則膽鹽水解酶的活性隨pH值的增加呈現先增高后降低的變化趨勢。N1、N12和WCFS1的酶活性變化趨勢符合，均在pH為7.0時，其酶活性最強，當pH超過7.0時，酶活性受到抑制作用。同時，pH對膽鹽水解酶活性有極顯著影響(P<0.01)，分析以上現象，在培養環境過酸、過堿時，會導致BSH化學變性而引起空間結構的改變，可能影響與底物結合的活性位點，導致水解效率降低。

2.4.3 紫外照射時間對膽鹽水解酶活性的影響

菌株經不同紫外照射時間處理后的BSH活性變化趨勢如圖5所示。

圖5 紫外照射時間對酶活性影響

紫外照射時間與上清液甘氨酸濃度不成線性關系，隨時間的延長，甘氨酸濃度波動無規律。N12與WCFS1經一定時間的紫外照射后，其水解生成的甘氨酸濃度較低，均低于在相同處理條件下N1的甘氨酸生成量，因此猜測N1菌株對紫外的耐性比N12、WCFS1強。由此現象可知，3株菌在紫外照射30 min內，其酶活性紊亂不定，水解生成的甘氨酸濃度呈波動變化，無法判斷此條件對酶活力是否產生明顯的促進作用或抑制作用。

2.4.4 溫度對膽鹽水解酶活性的影響

菌株經不同溫度處理后的BSH活性變化趨勢如圖6所示。

圖6 溫度對酶活性影響

N1、N12和WCFS1的酶活性隨短時溫度處理的度數增加，呈現先增強后減弱的變化趨勢，3株菌均在59 ℃下處理30 min后，其水解生成的甘氨酸濃度最大，膽鹽水解酶活性最強，耐熱性能良好，但在70 ℃下處理30 min后，菌種幾乎失活無法經過后期培養產生膽鹽水解酶，且結果顯示溫度處理對膽鹽水解酶活性有極顯著影響(P<0.01)。此項試驗意在探究短時溫度處理能否起到激活酶活性的作用，分析此現象，菌種均在試驗溫度下處理30 min后于37 ℃培養24 h，并未在試驗溫度下直接培養24 h，因此猜測酶的空間結構并未全部破壞，短時間的高熱處理，甚至可能使酶在保證原有活性的基礎上暴露更多的酶活性位點，以提高酶水解能力。

2.4.5 葡萄糖濃度對膽鹽水解酶活性的影響

菌株在不同糖濃度環境下培養后，其BSH活性變化趨勢如圖7所示。

圖7 葡萄糖添加量對酶活性影響

葡萄糖作為培養基中的重要碳源，碳源直接影響菌體的生長與代謝及水解酶的合成與作用。添加量過少，菌體生長緩慢導致水解酶合成量受限，添加量過多產生阻遏作用，抑制水解酶的合成。結果顯示，隨葡萄糖濃度的逐增，3株菌生成的甘氨酸先增后減，N12在葡萄糖重量百分比濃度為5%時，酶活性已達峰值，而N1與WCFS1峰值在濃度增至10%才出現峰值，N12糖濃度的耐受力弱于N1。當濃度由10%增至15%時，酶活性驟減，此后再增大糖濃度對酶活性的影響甚微。根據統計，糖添加量對BSH活性有極顯著影響(P<0.01)，其葡萄糖質量百分比濃度在5～10%范圍內，BSH持有較高酶活力。

2.4.6 NaCl濃度膽鹽水解酶活性的影響

菌株在不同鹽濃度環境下培養后，其BSH活性變化趨勢如圖8所示。

圖8 NaCl添加量對酶活性影響

NaCl可調節細胞內外滲透壓，在等滲環境下菌株正常生長，高滲環境下菌株失水抑制其生長。結果顯示，甘氨酸濃度隨NaCl量的增加呈先增后減的趨勢。N12在NaCl質量分數為4%時，酶活力最強，此后活力驟減再趨于平穩，N1的耐鹽能力強于N12，當質量分數增至7%時，酶活力最強，NaCl質量在7%～13%，酶活性驟減。根據統計，鹽添加量對BSH活性有極顯著影響(P<0.01)。

3 討論與結論

本研究從生鮮牛奶中共計分離乳酸菌27株，其中產膽鹽水解酶的乳酸菌共計2株，分別為N1、N12。通過細胞形態觀察和分子生物學技術，N1與N12被鑒定為植物乳桿菌(L.plantaruma)。N1、N12與植物乳桿菌Lp529[18]的BSH活性相比，后者較強，但N1、N12的BSH活性又強于植物乳桿菌KLDS6.0330[19]。

根據單因素多水平試驗，0～30 min的紫外照射處理對BSH活性影響甚微，不構成變化規律。但pH、溫度、糖鹽添加量對BSH活性有極顯著影響，從而確定了N1、N12保持BSH高活性的最適pH為7，最適溫度為59 ℃。其中N1的最適糖添加量為10%，最適鹽添加量7%。N12對糖、鹽的耐受力不及N1，其最適糖質量百分數為5%，最適鹽質量百分數為4%。這與李婷婷等[20]研究的屎腸球菌90-1的膽鹽水解酶的最適反應溫度(37 ℃)與最適反應pH(6.0)均不一致，可能因為李婷婷的試驗中僅僅在單因素條件下處理30 min，并未繼續培養24 h，導致出現的菌種水解活性差異性較大，以及菌種之間的差異性導致結果不同?；菝鞯萚21]研究發現BSH活性與還原糖的消耗速率有關，酶活性與消耗速率呈正相關，因此本試驗中確定了菌株N1、N12最適的糖質量百分比濃度。要將此類乳酸菌開發應用于食品工業中并發揮良好降解膽固醇能力，食鹽乃為食品工藝中最重要的調味品，其添加量過大對乳酸菌的抑制明顯[22]，添加量過小影響食品風味與質構，因此確定了N1、N12的最佳鹽質量百分比濃度，為后續的投入生產提供可靠的理論基礎。不同的培養條件對乳酸菌降解膽固醇的效率影響顯著[23]，對菌株N1和N12的培養條件等進行深入研究，為2株菌后續應用工業化生產奠定基礎。