高轉苷活性乳糖酶快速篩選方法的建立與初步應用

趙繼華，牛丹丹，NOKUTHULA Peace Mchunu，田康明，苗佳，王正祥,

1(工業發酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學 生物工程學院)，天津,300457) 2(天津科技大學 化工與材料學院，天津,300457) 3(Biotechnology Platform, Agricultural Research Council, Pretoria 0001, South Africa)

低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides，GOS)是一種公認的優質益生元，是功能性低聚糖的重要組成部分，以重要原輔料應用于乳品和代乳品、發酵制品、飼料和微生態制劑等工業[1-3]。通過酶法催化乳糖轉苷為半乳二糖、半乳三糖、半乳四糖等低聚半乳糖，是目前工業化制備GOS的主要方法。具有轉苷活性的乳糖酶則是制約這一產業發展的核心要素。長期以來，我國缺乏制備GOS所必需的高轉苷活性專業酶制劑，GOS產品質量與生產技術水平較低。

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, EC 3.2.1.23)，又稱乳糖酶(lactase)，能夠催化乳糖水解形成葡萄糖和半乳糖或轉苷形成低聚半乳糖[4-6]。利用乳糖酶的水解活性，可以進行牛奶中乳糖的水解，消除健康人群對乳糖的不耐受性；借助乳糖酶的轉苷活性，則可以將乳糖轉化為功能價值更優的GOS。在這一過程中，低聚半乳糖形成的比例取決于β-半乳糖苷酶的水解活性和轉苷活性比例關系[7-10]。因此，獲得具有高轉苷活性的β-半乳糖苷酶新酶分子，對推動酶法制備GOS技術進步極為重要。

現有評價β-半乳糖苷酶轉苷活性的方法，主要通過HPLC或TLC等檢測技術檢測樣本中GOS的形成量[11-12]。這些方法準確可靠，但檢測通量有限，無法應用于大規模樣本的快速篩選。為此，筆者研究并建立了一種基于GOS和生物量相關關系的新型高轉苷活性β-半乳糖苷酶的高通量篩選方法，運用此方法對菌種庫進行大規模篩選，獲得了具有顯著轉苷活性β-半乳糖苷酶的產酶菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究供試細菌分離物保藏物共3 759株，其中2 259株從中國高校工業微生物資源與信息中心(CICIM-CU)獲得，另1 500株細菌分離物為近期從乳品樣本和環境土樣等自然樣本中分離、鑒定并保藏。細菌的分子鑒定按實驗室常規方法進行[13]。

1.1.2 培養基

MRS培養基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，K2HPO42，檸檬酸三銨2，乙酸鈉5，葡萄糖20，吐溫-80 1(mL)，MgSO41，MnSO40.5，瓊脂粉20；pH 6.0。

篩選培養基A(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，K2HPO42，檸檬酸三銨2，乙酸鈉5，GOS 20，吐溫-80 1(mL)，MgSO41，MnSO40.5，瓊脂粉20；pH 6.0。

篩選培養基B(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，K2HPO42，檸檬酸三銨2，乙酸鈉5，乳糖5，半乳糖5，葡萄糖5，吐溫-80 1(mL)，MgSO41，MnSO40.5，瓊脂粉20；pH 6.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 指示菌的篩選

將待檢菌株用相應培養基活化后，分別點種于篩選培養基A和篩選培養基B，37 ℃培養60 h，記錄生長情況與生長菌落大小，分別標注為“-”或“+”。以“-”表示不生長，“+”表示有明顯生長，“+”越多表示菌落生長越顯著。

1.2.2 GOS-生物量相關關系

以篩選培養基A為基礎，調整其中的低聚半乳糖添加量分別為：0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0 g/L。接入指示菌后于37 ℃下液體培養一定時間，在600 nm下檢測指示菌株的生長情況，用OD600表示。

1.2.3 半乳糖基轉移活性的篩選

將待篩選菌株在37 ℃下培養24 h后，加入終濃度為200 g/L的乳糖，50 ℃條件下孵育12 h，離心收集上清再經0.2 μm濾膜過濾除菌后備用；將上述反應液按照體積分數10%的添加量，添加至不含GOS組分的液體篩選培養基A中；接入指示菌，于37 ℃培養下培養，檢測指示菌的增殖情況，用OD600值表示。

1.2.4 搖瓶發酵與酶液的制備

在250 mL三角瓶中進行，培養基為篩選培養基A液體培養基，裝液量為50 mL。培養在37 ℃、230 r/min下進行。發酵過程中定時取樣，離心收集上清液，分析酶活力。發酵結束時，離心取上清液并凍干，用于后續試驗。

1.2.5 β-半乳糖苷酶酶活力測定

β-半乳糖苷酶酶活力測定：1 mL反應體系中含有200 g/L的乳糖和一定體積的酶液，用0.05 mol/L的醋酸緩沖液調節pH至5.0，在50 ℃水浴中反應12 h。反應結束后，在沸水中滅活20 min，再通過生物傳感儀檢測葡萄糖的含量。β-半乳糖苷酶的活性定義為：在pH 5.0、50 ℃下1 min催化乳糖底物釋放1 μmol/L葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位(u)。

1.2.6 酶解乳糖及其產物分析

采用300 g/L乳糖為底物，添加20 u/g的β-半乳糖苷酶，反應在50 ℃下進行，定時取樣，采用HPLC法分析酶促產物特征與生成。色譜條件為：流動相為體積分數65%乙腈，1.0 mL/min流速；TSK-GEL G3000PWXL-CP(7.8 mm×300 mm，7 μm)色譜柱，柱溫25 ℃；蒸發光散射檢測器，漂移管溫度90 ℃，載氣流速2.2 mL/min。

2 結果與討論

2.1 指示菌的獲得

鑒于現有GOS檢測方法無法用于乳糖酶轉苷活性的高通量篩選目的[11-12]，建立適合高通量篩選目的的篩選方法是必要的。為此，本文試圖建立起基于指示菌以GOS為碳源的生長狀況的高通量篩選方法。即：運用可利用GOS生長，但對乳糖、葡萄糖和半乳糖的代謝利用弱或不利用的微生物菌株為指示菌，進而以此菌對樣本中形成的GOS(細菌分離物形成的乳糖酶轉化乳糖為GOS)的生長為依據，篩選獲得具有轉苷活性乳糖酶產酶菌株。

對分離保藏的細菌菌株進行GOS為唯一碳源生長的篩選，并以乳糖、葡萄糖和半乳糖為混合碳源為對照，通過篩選，獲得了27株在GOS唯一碳源平板上生長，在乳糖、葡萄糖和半乳糖為混合碳源平板上不生長或生長較弱的菌株(表1)。具備指示菌屬性的細菌分離物主要來源于乳桿菌屬和雙歧桿菌屬，其中乳桿菌屬16株，雙歧桿菌屬9株，戊糖片球菌和糞鏈球菌各1株。以生長優勢最為明顯的長雙歧桿菌B1172菌株作為最佳指示菌用于后續研究。

表1 初篩獲得的指示菌株及其生長情況

注：“-”表示不生長，“+”表示有明顯生長，“+”越多表示菌落生長越顯著

2.2 指示菌B1172篩選靈敏度范圍確認

考察了指示菌B1172以GOS為碳源的生長情況(圖1)。以不添加GOS的篩選培養基為對照，添加1.0 g/L GOS后，菌株B1172生物量已超過0.5，比不添加GOS條件下菌株菌體量高10倍以上(對照條件下菌體積累量為0.05)?？梢?，培養體系中，較低的GOS質量濃度(≥1.0 g/L)下即可通過指示菌的生長情況反映出來，指示菌的生物量與GOS質量濃度存在良好的相關關系(圖1)，可以用于對樣本中GOS形成情況和形成量進行快速批量檢出。

圖1 GOS-指示菌B1172生物量相關關系

2.3 半乳糖基轉移酶活力的高通量篩選

在供試的菌種培養物中加入最終質量濃度為200 g/L的乳糖液，50 ℃反應后收集上清液用于GOS生成的快速檢測樣本，以10%的補加量替代篩選培養基A中的GOS碳源，接入指示菌B1172，培養后測定指示菌生長情況。從3 700余株細菌分離保藏菌中，獲得了5株具有較強轉化乳糖為GOS的菌株(表2)。進一步分析發現，菌株B0212和B2301的轉半乳糖苷酶活力主要集中于胞內，菌株B0809、B2809和B3156的轉半乳糖苷酶活力則主要集中于發酵液中；以菌株B2301為對象，進一步確認其乳糖酶產酶水平和催化GOS合成情況。

表2 轉半乳糖苷酶活高通量篩選結果

2.4 菌株B2301產酶水平及其催化GOS合成

在搖瓶發酵下，定時取樣并檢測乳糖酶酶活力。發酵中后期，由于菌株B2301的裂解等原因，可在其發酵上清液中測定到乳糖酶酶活力(圖2)，發酵95 h時發酵上清液中酶活力達到最高，約為2.5 u/mL。

圖2 搖瓶條件下菌株B2301產乳糖酶進程

以300 g/L乳糖為底物，添加20 u/g的B2301乳糖酶，在50 ℃下反應不同時間，取樣進行HPLC糖譜分析，結果見圖3?？梢钥闯?，B2301乳糖酶具有催化乳糖底物轉化為GOS的能力，最高轉化率可以達到54.5%；B2301乳糖酶水解乳糖的能力較低，僅生成較低水平的游離葡萄糖(圖3)。

圖3 B2301乳糖酶合成GOS的高能力

基于GOS依賴性生物量相關關系，建立了乳糖酶半乳糖基轉移酶活力的高通量篩選方法。現有乳糖酶酶活力測定方法[14-18]主要包括：1)使用天然底物乳糖，通過檢測葡萄糖和/或半乳糖的生成量確定酶活力；2)使用化學合成底物，如鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，通過檢測所生成的發色產物生成量確定酶活力。上述方法皆基于乳糖酶的水解活性，無法應用于乳糖酶的轉苷活性的檢測與篩選。HPLC是目前定量檢測GOS組成與含量的基本方法，但操作成本與操作時限無法滿足高通量篩選目的[11,19]。本文首次報道了基于GOS-指示菌生物量相關關系的高轉苷活性乳糖酶的高通量篩選方法，成功用于具有轉苷活性的乳糖酶產生菌株的篩選，此方法也將有助于后續乳糖酶的轉苷活性分子進化突變庫的高通量篩選。

3 結論

基于GOS-生物量相關關系，建立了一種高轉苷活性乳糖酶的高通量快速篩選方法，成功運用此方法進行了3 700余株細菌分離物的篩選并獲得高轉苷活性乳糖酶產生菌。