光滑球擬酵母發酵生產丙酮酸的補料過程優化

郭李坤，曾偉主，周景文*

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

丙酮酸(pyruvic acid)是一種重要的小分子有機酸，在臨床上可以用于治療抑郁癥和創傷性腦損傷[1]，也常用來制備谷物保護劑和氫化阿托酸[2]，還可用作食品添加劑改善人體機能[3]。目前，丙酮酸的生產方法主要有化學合成法、酶轉化法以及微生物發酵法。工業生產常用的方法是化學合成法，主要為酒石酸法，但這種方法成本普遍較高且對環境污染嚴重[4]。酶轉化法是利用微生物中某些酶催化底物分子結構中的某一部分轉變為與底物結構類似的物質[5]。多年來研究者利用了不同的酶，如L-氨基酸脫氨酶、丙酮酸合成酶、D-乳酸脫氫酶等催化不同底物以生產丙酮酸[6-9]。雖然酶轉化法具有較大的優勢，可以大幅度降低污染，而且有些具有較高的底物轉化率[10]，但是由于底物成本較高等條件的限制，實現產業化仍存在較大困難。

相比化學合成法和酶轉化法，微生物發酵法可以利用廉價的可再生碳源生產丙酮酸，大幅降低生產成本，同時能提高產品的安全性，降低生產過程中的污染。目前有一些微生物用于發酵法生產丙酮酸，如光滑球擬酵母[11]、釀酒酵母[12]、大腸桿菌[13]等。許多策略被開發用于強化丙酮酸的生產。周景文等[14]借助代謝工程及微生物生理學手段，闡述了光滑球擬酵母中ATP對胞內微環境的調控以及對菌株生長和丙酮酸合成機制的影響。徐沙等[15]借助多種組學技術解釋了光滑球擬酵母酸脅迫下的丙酮酸積累機制，并進一步改善了菌株的酸耐受性。羅正山等[16]通過控制能量代謝提高了糖酵解效率和丙酮酸的積累水平，最終丙酮酸搖瓶產量為40.2 g/L。目前關于微生物發酵法主要通過基因工程手段激活或改善胞內轉運途徑、糖酵解和TCA循環中靶基因的轉錄翻譯水平以強化丙酮酸的生產，有關發酵過程優化與控制的報道相對較少。

本研究通過對篩選得到的突變菌株進行發酵鑒定，對具有較強丙酮酸生產能力的光滑球擬酵母進行發酵優化。通過改善相關培養基成分與質量濃度，大幅度提高了搖瓶發酵水平。在此基礎上，進一步在15 L發酵罐上分析了發酵過程的動力學參數，設計了一種恒速補料流加方案，強化了丙酮酸的生產，為進一步提升工業水平丙酮酸發酵性能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒

光滑球擬酵母(Candidaglabrata)CCTCC M202019 4種維生素營養缺陷型菌株(硫胺素、生物素、煙酸、吡哆醇)，為本實驗室保存[17]，C.glabrata5D1、4C4、4A4，3G5、4H2和5C6為篩選得到的高產突變株[18]。

1.1.2 主要試劑

大豆蛋白胨、蛋白粉、酵母粉，Oxoid公司，硫胺素、吡哆醇、煙酸和生物素，Sigma-Aldrich公司，其他試劑來自國藥試劑。

1.1.3 培養基

YPD培養基(g/L)：蛋白胨 20，酵母膏 10，葡萄糖20。

種子培養基(g/L)：葡萄糖 30，大豆蛋白胨 10，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41，2 mol/L HCl調節培養基初始pH至5.5，于115 ℃下滅菌20 min。固體培養基中加入15～20 g/L瓊脂，于115 ℃下滅菌20 min。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖 120，尿素 3.86，MgSO4·7H2O 0.8，KH2PO42，CH3COONa 3。微量元素液 10 mL/L，維生素液 10 mL/L，于115 ℃下滅菌20 min。

微量元素液(g/L)：MnCl2·4H2O 12，FeSO4·7H2O 2，CaCl2·2H2O 2，CuSO4·5H2O 0.05，ZnCl20.5，用2 mol/L HCl溶解，過濾除菌后于4 ℃保存。

維生素液(g/L)：生物素 0.004，硫胺素 0.75 mg/L，吡哆醇 0.04，煙酸 0.8，用2 mol/L的HCl溶解，過濾除菌后于4 ℃保存[19]。

1.1.4 儀器與設備

安捷倫1200液相色譜儀，美國安捷倫公司；15 L全自動滅菌發酵罐，上海迪比爾生物工程有限公司；恒溫搖床，上海知楚儀器有限公司；恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠；臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；722s可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；葡萄糖-乳酸生物傳感器分析儀，深圳西爾曼科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養條件

種子培養：挑取活化的單菌落于液體種子培養基中，于30 ℃，220 r/min培養20～22 h。

搖瓶發酵培養：培養好的種子液以10%(v/v)的接種量接入裝有發酵培養基的搖瓶中，在30 ℃，220 r/min的搖床上進行發酵培養。同時加入40 g/L的CaCO3作為發酵過程中pH緩沖劑。

發酵罐培養：以10%接種量將培養好的種子液轉接到15 L發酵罐中，總裝液量為9 L，攪拌轉速600 r/min，通氣量9 L/min，8 mol/L NaOH溶液調節pH恒定控制在5.5，30 ℃下培養。發酵過程中多次取樣測定菌株的發酵參數。

1.2.2 分析方法

(1)

式中：ρ，丙酮酸最終質量濃度，g/L;V,發酵液總體積，L;m,總耗糖質量，g。

采用Origin 2019b對單因素實驗結果進行顯著性分析，統計顯著性表示如下，*為P<0.05, **為P<0.01。

2 結果與分析

2.1 高產丙酮酸生產菌株的篩選

實驗篩選獲得的光滑球擬酵母菌株共7株，分別為C.glabrataCCTCC M202019、5D1、4C4、4A4，3G5、4H2和5C6。在相同條件下，對該7株菌株進行搖瓶水平發酵。通過高效液相色譜對各菌株丙酮酸的最終產量進行檢測，得到相對高產的丙酮酸生產菌株。

由圖1和表1可以看出，7株菌株丙酮酸最終產量有所差異。其中C.glabrata4H2的丙酮酸產量相對最高，達到(38.85±0.16)g/L，丙酮酸生產強度qv為0.61 g/(L·h)，糖酸轉化率Q(丙酮酸/葡萄糖)為0.32 g/g。綜上，選擇菌株C.glabrata4H2進行進一步地發酵優化以強化丙酮酸的生產。

2.2 氮源及其濃度對丙酮酸發酵過程的影響

氮源作為種子液中最重要的組成成分，其種類對種子的生長代謝有重要影響。本研究中，在搖瓶水平首先比較了大豆蛋白胨、大豆蛋白粉、玉米蛋白粉3種不同氮源對發酵的影響。通過比較發酵過程中菌體生長和產物丙酮酸積累的差異，確定種子培養基中的最佳氮源種類。由圖2-A及2-B可知，在以大豆蛋白胨作為氮源時，菌株丙酮酸產率和菌體生長濃度均為最佳。

圖1 篩選菌株丙酮酸產量對比

表1 篩選菌株發酵參數的對比

在確定該菌株丙酮酸生產最佳的氮源為大豆蛋白胨之后，繼續選取了4個濃度梯度的該種氮源進行發酵，以探究該種氮源的添加量對丙酮酸發酵的影響。不同濃度的大豆蛋白胨對丙酮酸的產率和菌體的生長有著不同程度的影響。由圖2-C可知，在大豆蛋白胨質量濃度為10 g/L時，丙酮酸產量和菌體生長狀況都相對較好，在15 g/L時，丙酮酸產量有所下降。對比丙酮酸產量并考慮經濟性因素，確定發酵生產最適氮源為大豆蛋白胨，且其添加的質量濃度為10 g/L。

2.3 搖瓶水平發酵檢測

將菌株C.glabrata4H2在上述優化后的培養基中培養，接種至250 mL搖瓶中進行發酵，結果如圖3-A所示。菌株在52 h丙酮酸產量即達到(48.56±0.46)g/L，丙酮酸生產強度為0.93 g/(L·h)，糖酸轉化率為0.46 g/g，比優化之前(圖3-B)分別提高25.0%、52.5%和43.8%。由圖3-C和3-D可看出，在前14.3和25.1 h，菌株在優化培養基中的比生長速率和產物比合成速率均強于優化前，表明菌株前中期具有更好的生長狀況，以及具有較快的丙酮酸積累速率。其最大比生長速率與最大比丙酮酸合成速率分別為0.21 h-1和0.42 g/(g·h)，比優化前有所提升。

A-氮源種類對丙酮酸產量的影響；B-氮源種類對菌體生長的影響；C-大豆蛋白胨濃度對產量及菌體生長的影響

A-優化后搖瓶發酵過程；B-優化前搖瓶發酵過程；C-菌體比生長速率曲線；D-菌體丙酮酸比生成速率曲線

2.4 15 L發酵罐分批發酵

經過上述在搖瓶水平對種子培養基成分進行探索和驗證后，確定了種子培養基的基本組分，在15 L發酵罐中進行菌株4H2的分批發酵培養(圖4-A)。發酵0～16 h時，葡萄糖的消耗速率較為緩慢，丙酮酸產量處于較低水平;16 h之后，葡萄糖含量以較快速率下降，丙酮酸產量也迅速提升，并在70 h時達到最高值，最終丙酮酸產量為(67.81±0.27)g/L，較搖瓶水平提高39.64%。由圖4-B和4-C可知，15 L發酵罐中分批發酵菌株最高比生長速率為0.19 h-1，最高比丙酮酸生產速率為0.41 g/(g·h)，與搖瓶水平發酵動力學參數基本相同。上述結果表明，在15 L發酵罐中進行放大發酵培養，可在不影響菌體生長的情況下提高光滑球擬酵母積累丙酮酸的能力。

2.5 15 L罐流加補料發酵

2.5.1 流加發酵總糖濃度的影響

基于上述結果，在15 L自動發酵罐中對突變株4H2進行恒速補料發酵優化。初始葡萄糖濃度設為120 g/L，分別流加20、30、40 g/L質量濃度的葡萄糖。結果表明，在發酵前期丙酮酸產量很低，16 h之后丙酮酸產量迅速增加，葡萄糖消耗速率也逐漸增加，在28 h時已消耗至55～60 g/L，為延長細胞對數生長期和平衡期的持續時間，增加生物量及平衡期細胞代謝產物的積累，對其進行底物的流加發酵。當補料質量濃度為20 g/L時，發酵中后期葡萄糖消耗速度較快，在76 h時葡萄糖濃度幾乎耗完，丙酮酸最終產量為(76.36±0.26)g/L(圖5-A)。當補料質量濃度提高至30 g/L時，在發酵的中后期，丙酮酸含量繼續以較高合成速率上升，在進行至64 h時，產量為73.79 g/L，丙酮酸合成速率放緩，在81 h時產量達到(80.15±0.35)g/L，糖酸轉化率為0.69 g/g，生產強度0.99 g/(L·h)(圖5-B)。繼續提高補料濃度至40 g/L，發酵進行至76 h時丙酮酸的產量基本保持不變，最終產量為(78.42±0.33)g/L，直到87 h，培養基中仍有8.8 g/L的葡萄糖未耗盡(圖5-C)。綜上所述，考慮到丙酮酸終產量及經濟效益等因素，選擇30 g/L質量濃度的葡萄糖進行流加補料。

A-15 L發酵罐分批發酵過程；B-菌體比生長速率曲線；C-菌體丙酮酸比生成速率曲線

流加葡萄糖質量濃度分別為：A-20 g/L; B-30 g/L; C-40 g/L

2.5.2 初始糖濃度的影響

在以葡萄糖為主要原料的發酵生產中，初始葡萄糖的質量濃度會對丙酮酸的生產有很大影響，因此為進一步改善丙酮酸的發酵過程，需要尋找一個適宜的初始葡萄糖質量濃度。為此，選擇40、60、80、100、120、140 g/L的初始糖濃度，以探究其對C.glabrata4H2的生長以及丙酮酸的積累的影響。由圖6-A可知，較高濃度的初始葡萄糖(120、140 g/L)會對菌體的生長產生抑制，較低質量濃度的初始葡萄糖在前期可較快達到較高的細胞比生長速率。由圖6-B可看出，20 h后初始濃度為40 g/L的發酵培養基葡萄糖耗盡；初始糖濃度為80 g/L時，丙酮酸/DCW值最高，為(2.26±0.02)g/g；24 h后初始濃度為60 g/L的發酵培養基葡萄糖耗盡，此時初始糖濃度為80 g/L時菌株丙酮酸/DCW依然最高，達到(2.65±0.01)g/g，而葡萄糖濃度為140 g/L時，丙酮酸/DCW明顯降低。表明初始培養基中高濃度的葡萄糖對前期的菌體發酵確實存在抑制作用。綜上所述，選擇初始葡萄糖濃度為80 g/L的培養基進行發酵。

A-不同初始葡萄糖質量濃度對比生產速率的影響；B-不同初始葡萄糖質量濃度對單位菌體丙酮酸生成能力的影響

2.5.3 補料時機對發酵的影響

為進一步強化光滑球擬酵母突變菌株生產丙酮酸，繼續考察了補料時機對發酵過程的影響。初始糖質量濃度為80 g/L，以發酵液中的葡萄糖質量濃度為參考，分別選取其濃度降低至65、55、45、35以及25 g/L五個不同濃度時期進行補料，為保持葡萄糖總濃度為150 g/L，補加的葡萄糖質量濃度為70 g/L。對比發現，如圖7-A，當發酵進行至12 h時，殘糖為65 g/L時進行補料，此時葡萄糖消耗速度相對較慢，其濃度迅速積累，81 h發酵結束時丙酮酸終產量為(81.37±0.42)g/L, 生產強度為1.01 g/(L·h)。如圖7-C和7-D，當發酵分別進行至23與27 h時，葡萄糖含量分別降低至45與35 g/L，分別在此時進行補料流加，發現這2種補料策略在發酵中后期的耗糖速率均較快，丙酮酸的終產量分別為(79.94±0.72)g/L和(83.62±0.86)g/L。如圖7-E，當發酵進行至33 h時，葡萄糖質量濃度降低至約25 g/L進行補料，發現菌株在72 h后葡萄糖消耗速率嚴重降低，發酵至91 h時，發酵液中仍有約22.3 g/L的葡萄糖未被利用，丙酮酸終產量僅為(72.58±0.33)g/L，生產強度與底物利用率均較低，表明在發酵后期高質量濃度的葡萄糖對丙酮酸合成具有一定的抑制作用。如圖7-B，當發酵至17 h時，葡萄糖含量降低至55 g/L時進行補料流加，發現中后期葡萄糖消耗較快，丙酮酸的終產量最高，達到(86.63±0.29)g/L，糖酸轉化率為0.78 g/g，生產強度為1.07 g/(L·h)。

剩余葡萄糖質量濃度分別為: A-65 g/L; B-55 g/L; C-45 g/L; D-35 g/L; E-25 g/L

3 討論

丙酮酸作為一種重要的工業原料，廣泛應用于制藥、日化、食品以及農業等領域[21]。目前主要通過基因工程手段激活或改善細胞中轉運途徑、糖酵解或TCA循環中某些靶基因的轉錄翻譯水平以強化丙酮酸的生產[16]，有關發酵過程優化與控制的報道相對較少。本文從7株菌種鑒定出最佳菌株C.glabrate4H2，并對其生產丙酮酸的發酵過程進行優化，確定了最佳種子培養基相關成分以及質量濃度。在此條件下，搖瓶水平發酵52 h丙酮酸最高產量為(48.56±0.46)g/L，生產強度為0.93 g/(L·h)，糖酸轉化率為0.46 g/g，較未優化前分別提高了25.0%、52.5%和43.8%。在此基礎上進行15 L發酵罐的放大發酵，丙酮酸產量達(67.8±0.27)g/L，并對過程中的發酵動力學參數進行了分析。進一步對15 L罐中流加發酵生產丙酮酸的工藝進行探究，確定了總葡萄糖質量濃度為150 g/L，初始葡萄糖為80 g/L，并在剩余葡萄糖濃度為55 g/L時進行恒速補料的策略，最終丙酮酸產量、糖酸轉化率和生產強度分別達到(86.63±0.29)g/L、0.78 g/g和1.07 g/(L·h)。已有的研究表明，光滑球擬酵母代謝副產物多糖的積累是影響丙酮酸轉化率提升的主要原因之一[22-23]。近年來，關于光滑球擬酵母的基因編輯方法日趨成熟[24-25]。在后續研究中，通過建立光滑球擬酵母高效基因編輯系統并弱化潛在副產物合成相關基因表達，以及對胞內中心化合物進行精細調控，有望進一步提升丙酮酸積累水平。本研究相關優化與補料策略為利用光滑球擬酵母發酵生產丙酮酸的放大實驗提供了理論與技術參考。