CDK1、CENPT和P53在乳腺癌中的表達及意義

趙若晗　史嘉翊　劉馨璥　宋潔

【摘要】 目的：研究CDK1、CENPT和P53在乳腺癌中的表達情況，探討基因表達與乳腺癌患者生存率及病理階段分型的關聯性和調控關系。方法：GEPIA數據庫分析乳腺癌和正常樣本中的表達與總體生存率，乳腺癌患者基因表達與病理分期影響，CENPT與CDK1、BAX、BCL2、CASP3、P53的相關性分析，UALCAN數據庫驗證結果。敲減CENPT后，半定量PCR檢測CDK1、BAX、BCL2、CASP3、P53在MCF7細胞系中的表達。結果：CDK1、CENPT在乳腺癌及正常組織表達比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;CDK1、BCL2表達與不同病理分期比較，差異有統計學意義（P<0.05）;P53不同表達乳腺癌患者總體生存率比較，差異有統計學意義（P<0.05）;乳腺癌MCF7細胞系敲減CENPT后P53、BAX、CASP3表達量均減少（P<0.05）。結論：與正常組織比較，在乳腺癌中CENPT表達水平降低，CDK1表達水平升高;P53表達水平與生存率成反比。乳腺癌中CENPT、P53、Bax、CASP3信號通路調節細胞凋亡參與乳腺癌的進展。

【關鍵詞】 乳腺癌 生物信息學 CENPT CDK1

Effect and Expression of CENPT， CDK1 and P53 in Breast Cancer/ZHAO Ruohan， SHI Jiayi， LIU Xinjing， SONG Jie. //Medical Innovation of China， 2020， 17（09）： 0-031

[Abstract] Objective： To discuss the expression of CENPT， CDK1 and P53 in breast cancer， to explore the correlation and the regulatory relationship between gene expression and survival rate and pathological stage classification of breast cancer patients. Method： GEPIA database was used to analyze the expression and overall survival rate of breast cancer and normal samples， the pathological stage and gene expression in breast cancer patients， the correlation between CENPT and CDK1， BAX， BCL2， CASP3， P53， and the validation results of UALCAN database. RT-PCR was used to detect the expression of CDK1， BAX， BCL2， CASP3 and P53 in MCF7 cell lines after knocking down CENPT. Result： The expression of CDK1 and CENPT in breast cancer and normal tissues were significantly different （P<0.05）. The expression of CDK1 and BCL2 was significantly different from those of different pathological stages （P<0.05）. The different expression of P53 was significantly different in the overall survival rate of breast cancer patients （P<0.05）. The expression of P53， BAX and CASP3 in breast cancer MCF7 cell lines decreased after CENPT knockout （P<0.05）. Conclusion： Compared with normal tissues， the expression level of CENPT in breast cancer is lower and the expression level of CDK1 is higher， and the expression level of P53 is inversely proportional to the survival rate. CENPT， P53， Bax， CASP3 signaling pathway regulates apoptosis in breast cancer and participates in the progression of breast cancer.

[Key words] Breast cancer Bioinformatics CDK1 CENPT

First-authors address： Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.09.007

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國發病率為16.8%，且每年3%～4%遞增[1]，文獻[2]證實細胞周期調控分子參與腫瘤進程。Cyclin dependent kinase 1（CDK1）通過Centromere specafic proteins T（CENPT）調控動粒核心蛋白網絡[3-4]。異常CDK1調控使細胞周期紊亂導致腫瘤發生[3]。磷酸化P53（tumor protein 53）誘導P21轉錄抑制CDK1活性。P53激活BCL2-Associated X（BAX）通路通過Caspase 3誘導凋亡[5]。CDK1、CENPT、P53與乳腺癌相關性未見報道，因此本文以三者為切入點探討它們在乳腺癌中的作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 乳腺癌MCF-7細胞系由哈爾濱工業大學癌生物學實驗室惠贈，DMEM高糖培養基、胎牛血清、雙抗、PBS、RNA提取試劑、Taq Mix、引物均購于生工生物有限公司，siRNA購自銳博生物有限公司。

1.2 在線數據庫使用 GEPIA（gepia.cancer-pku.cn）進生物信息學處理。對乳腺癌和正常樣本CENPT、CDK1、P53、BAX、BCL2、CASP3表達與患者病理分級、生存率及CENPT相關性數據進行分析，并用UALCAN（ualcan.path.uab.edul）驗證。

1.3 細胞培養與siRNA轉染 10% FBS的DMEM培養基培養MCF-7，Count star計數5次平均值。細胞80%時按說明書轉染。

1.4 RT-PCR 檢測基因的表達 試劑盒提取cDNA，擴增程序95 ℃ 5 min（95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s）×30次;72 ℃ 5 min，4 ℃保存。凝膠電泳分析條帶。

1.5 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。One-way ANOVA分析與乳腺癌患者病理分期相關性，Log-rank時序檢驗分析乳腺癌患者總體生存率。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌與正常樣本中基因表達情況 GEPIA分析1 085例乳腺癌和291例正常樣本log2（TPM+1）對數比差異見圖1A。CENPT、CDK1差異均有統計學意義（P=0.000 031、0.000 004），CDK1、P53、BAX、BCL2、CASP3在乳腺癌中均高表達，CENPT與其他表達趨勢相反。UALCAN趨勢一致見圖1B。

2.2 乳腺癌患者病理分期與表達分析 乳腺癌樣本F分布>3，log2（TPM+1）對數假設檢驗P值單向病理階段差異分析，Pr（>F）<0.05為顯著，見圖2。CDK1、BCL2表達對不同病理分期患者有統計學意義（F=5.17、3.2，P=0.000、0.012 6），BCL2表達隨病理分期進展而降低，CDK1一期到二期上升。

2.3 乳腺癌患者總體生存率時序檢驗與表達分

析 GEPIA分析乳腺癌患者基因表達與生存率，Cox PH計算危險比見圖3A、3B。同一時間低表達P53（HR=1.4，P=0.038）存活人數高于高表達，隨著時間推進差異更明顯。其他相關基因表達水平對乳腺癌患者的總體生存率影響均無統計學意義（P>0.05），與UALCAN趨勢一致見圖3C。P53高表達人群總體生存率危險比最高生存力最低，依次為CDK1、CASP3、BCL2、CENPT、BAX。

2.4 CENPT與CDK1、P53、BAX、BCL2、CASP3相關性分析 GEPIA分析基因表達相關性，PEARSON對數可視化，|R|=1相關性最強。CENPT與CASP3（P=5.2×10-54，R=-0.4）、CDK1（P=1.8×10-27，R=-0.29）、P53（P=8.5×10-21，

R=-0.25）相關性較強，與BCL2（P=3.7×10-13，R=-0.19）、

BAX（P=3.3×10-9，R=-0.16）較弱見圖4A。半定量PCR分析，CENPT敲減前為（0.143±0.008），敲減后為（0.011±0.001），敲減前后比較差異有統計學意義（t=15.900，P=0.000）;MCF7中P53、CASP3、BAX分別由（0.053±0.003）、（0.068±0.004）、（0.043±0.002）減少至（0.009±0.001）、（0.028±0.002）、（0.022±0.001），差異均有統計學意義（t=14.099、9.373、7.623，P=0.000、0.002、0.002）;CDK1、BCL2表達變化比較，差異均無統計學意義（P>0.05）見圖4B、C。

3 討論

細胞增殖與細胞凋亡與腫瘤密切相關。遺傳物質的不平衡是腫瘤進展的重要特征。染色體不穩定性產生主要涉及染色體的著絲粒、監測點等原因[6]。因此，著絲粒結構和功能的研究是探討腫瘤細胞周期、細胞凋亡的切入點[7]。

本文分析探討低表達CENPT與乳腺癌發生發展關系。數據庫分析乳腺癌和正常樣本CENPT、CDK1、BAX、BCL2、P53、CASP3表達，CENPT在

乳腺癌表達水平低于正常樣本，與其他相反，其中CDK1最顯著。CENPT與CASP3、CDK1、P53的相關性比BCL2、BAX強。P53對患者的總體生存率影響差異有統計學意義（P<0.05），成反比。敲低CENPT后P53、CASP3、BAL2表達量均減少（P<0.05），CDK1、BCL2差異均不顯著（P>0.05）。CENPT調控CDK1周期動粒蛋白網絡系統。雖然敲低CENPT后CDK1在轉錄水平變化不明顯，但可能磷酸化的CDK1會引發細胞周期紊亂導致腫瘤的發生，同時P53可被CDK1-Cyclin復合物磷酸化誘導P21轉錄，P21抑制CDK1活性[8]，導致腫瘤發生。敲減CENPT后P53、BAX、CASP3表達量均減少，可能因為細胞凋亡是由基因控制細胞的主動自主有序死亡，涉及一系列基因的激活、表達及調控作用[9-10]。P53異常抑制抗凋亡因子BCL2，且BAX被P53轉錄激活導致P53成功誘導凋亡[11-12]。凋亡小體前提活化胱天蛋白酶家族CASP3參與凋亡執行、降解多種底物導致，E2F誘導BCL2促凋亡蛋白表達，P53突變功能喪失，凋亡小體活化，BAX突變失活BCL2表達失調[13-15]。CASP3能被P53及外界刺激細胞信號活化，釋放BAX等促凋亡蛋白[16]，增強癌細胞控凋亡途徑。

綜上所述，乳腺癌中CENPT表達下調抑制P53，從而抑制BAX、CASP3凋亡通路參與乳腺癌進展。CENPT是否抑制P53下調P21、激活CDK1活性、調節細胞周期分子機制還需進一步研究。

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（收稿日期：2019-10-30） （本文編輯：程旭然）

*基金項目：黑龍江省省屬高等學校基本科研業務費項目（2018-kyywfmy-0030）;牡丹江醫學院研究生創新基金項目（2018YJSCX-33MY）