小柴胡湯加減對(duì)家兔膜性腎病的療效

胡歡歡 尹鳳仙 崔鎮(zhèn)花

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，吉林 延吉 133000)

膜性腎病(MN)發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，它是成人原發(fā)性腎病綜合征常見(jiàn)的一種病理類型，其特點(diǎn)是腎小球上皮細(xì)胞下電子致密物的沉積及非炎癥性病理變化，最終可導(dǎo)致腎小球基底膜增厚〔1,2〕。本研究通過(guò)建立用陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(C-BSA)制成的家兔原位免疫復(fù)合物性膜性腎病模型，用小柴胡湯加減中藥方，觀察其療效，并探討可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 白色雄性家兔28只，體重2.0～2.5 kg，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，視正常生長(zhǎng)(期間查尿蛋白全部陰性)，隨機(jī)分為正常組(n=5)；模型組(n=8)；中藥組(n=8)；潑尼松組(n=7)。

1.2藥物 中藥復(fù)方由小柴胡湯(人參、炙甘草、柴胡、黃芩、半夏、生姜、大棗)去半夏加黃芪、靈芝、絞股藍(lán)組成，將上述中藥水煎，濃縮成每毫升含生藥2 g。

1.3模型制備 C-BSA的制備參照文獻(xiàn)〔3,4〕并加以改良。第1周預(yù)免疫：每1.5 ml磷酸鹽緩沖液中(pH7.4)含大腸桿菌內(nèi)毒素1 μg和C-BSA 1 mg。每只兔耳緣靜脈注射1.5 ml。第2周開(kāi)始正式免疫：家兔每只均耳緣靜脈注射C-BSA 15 mg/d，6次/w，共4 w。第6周起劑量加倍，30 mg/w，6次/w，共2 w。正常組每日注射生理鹽水2 ml。8 w后處死。

1.4給藥 實(shí)驗(yàn)第3周開(kāi)始中藥組灌飼中藥組按10 g/(kg·d)。潑尼松組灌飼潑尼松15 mg/d，直到第8周末處死動(dòng)物為止。各實(shí)驗(yàn)組每日喂食顆粒飼料150 g左右，自由飲水。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1生化指標(biāo)和尿蛋白測(cè)定 用磺基水楊酸法測(cè)24 h尿蛋白定量，測(cè)血清白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、血尿素氮(BUN)及血肌酐(Scr)檢查(日立公司制7150型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定)，測(cè)定24 h尿β2-微球蛋白(MG)、尿ALB、尿免疫球蛋白(Ig)G排出量(放射免疫法測(cè)定)。

1.5.2腎臟病理學(xué)檢查 ①光鏡檢查：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取每只兔子的部分腎組織常規(guī)HE、PAS和PAM-Masson染色，制片后光鏡觀察。圖像分析取每個(gè)腎標(biāo)本連續(xù)計(jì)數(shù)50個(gè)腎小球通過(guò)SEM-IPS圖像分析系統(tǒng)(BH2奧林巴士顯微鏡，全部放大倍數(shù)400倍)測(cè)出每個(gè)腎小球的直徑。②電鏡及腎小球基底膜(GBM)陰離子位點(diǎn)檢查：仿Schurer等〔5〕方法略改善，取每組兩只動(dòng)物腎皮質(zhì)數(shù)塊，用1%聚乙烯亞胺(PEI，分子量1 800 D，用等滲鹽水稀釋，1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.4)浸泡30 s，再加入二甲砷酸鈉緩沖液沖洗后，置于2%磷鎢酸/2.5%戊二醛溶液中(0.1 mol/L二甲砷酸緩沖液稀釋)室溫下固定2 h，二甲砷酸沖洗后按標(biāo)準(zhǔn)方法制片，在JE-1200EX型透射電鏡下觀察GBM電荷染色情況及毛細(xì)血管襻超微結(jié)構(gòu)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1動(dòng)物一般情況 體重：正常組動(dòng)物體重平均增加0.53 kg；模型組平均增加0.18 kg；中藥治療組平均增加0.45 kg；潑尼松組平均減少0.58 kg。動(dòng)物生存情況：共死亡兔4只，其中牛血清過(guò)敏反應(yīng)2只(中藥組1只、潑尼松組1只)；死于衰竭2只(模型組1只、潑尼松組1只)。

2.2生化指標(biāo)及尿蛋白測(cè)定 實(shí)驗(yàn)第3周時(shí)，與模型組相比，中藥組血TG、血TC，潑尼松組血TC，正常組血ALB、血TG、血TC差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；中藥組與潑尼松組比較各生化指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；正常組血TG、血TC與潑尼松組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)，與模型組相比，中藥組血Scr、血ALB、血TG、血TC，潑尼松組血Scr，正常組血Scr、血ALB、血TG、血TC差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；中藥組與潑尼松組比較血TG、血TC有顯著差異(P<0.01)；正常組血TG、血TC與潑尼松組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。模型組實(shí)驗(yàn)第6周末24 h尿蛋白達(dá)高峰后呈明顯下降趨勢(shì)，第6、8周與中藥組及潑尼松組同期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)第8周末，中藥組尿蛋白排出量明顯少于潑尼松組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；各時(shí)間點(diǎn)各組24 h尿蛋白水平均較正常組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表1 各組血液生化指標(biāo)比較

與模型組比較:1)P<0.01；與潑尼松組比較:2)P<0.01

表2 各組實(shí)驗(yàn)第2、4、6、8周24 h尿蛋白水平

與模型組比較：1)P<0.01；與潑尼松組比較：2)P<0.01；與正常組比較：3)P<0.01

2.3各組實(shí)驗(yàn)第2、8周24 h尿β2-MG、ALB、IgG排出情況 第2周，各組24 h尿β2-MG、ALB、IgG排出量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第8周，與模型組比較，正常組β2-MG、IgG、ALB排出量，中藥組及潑尼松組IgG、ALB排出量均明顯低于模型組(均P<0.01)，中藥組IgG，模型組IgG、ALB排出量均明顯高于潑尼松組(均P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 各組實(shí)驗(yàn)第2、8周β2-MG、ALB、IgG排出情況

2.4腎臟病理變化 光鏡下除正常組外各實(shí)驗(yàn)組均有不同程度腎小球肥大，腎小球毛細(xì)血管壁增厚，系膜增生，蛋白滲出及新月體形成，腎小管管腔擴(kuò)張，上皮細(xì)胞壞死脫落，腎小管腔內(nèi)有蛋白管型，間質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，動(dòng)脈壁增厚等變化，見(jiàn)圖1。PAM-Masson染色基膜上皮側(cè)可見(jiàn)三色染色呈紅色的蛋白樣物質(zhì)沉積及嗜銀的釘突形成，其中模型組變化最大。家兔腎小球直徑中藥組為(133.25±36.78)μm，潑尼松組(123.71±26.16)μm，模型組(169.38±32.20)μm，正常組(88.80±23.12)μm。模型組與治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。中藥組與潑尼松組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

電鏡下正常家兔基底膜外疏松層陰離子位點(diǎn)呈高密度，顆粒較大，且規(guī)則分布，內(nèi)疏松層低密度不規(guī)則分布，上皮細(xì)胞表面未發(fā)現(xiàn)PEI染色顆粒。模型組陰離子位點(diǎn)顯著減少，顆粒小。兩治療組陰離子位點(diǎn)部分呈單層，部分雙層，顆粒大小也與正常組近似，部分足突完整。見(jiàn)圖2。

圖1 各組腎臟病理變化(HE，×400)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小柴胡湯和潑尼松均能減少尿ALB、尿IgG排出，可減少24 h尿蛋白排出，提高血ALB，糾正脂質(zhì)代謝紊亂，其中潑尼松組無(wú)明顯降血脂作用。兩種藥均能減少基底膜電荷丟失，表明兩組均能對(duì)腎小球的電荷屏障和分子屏障起到一定的保護(hù)作用。本文中藥組家兔在改善一般狀態(tài)如進(jìn)食、體重變化及提高血ALB、減少尿蛋白、降血脂等方面明顯優(yōu)于潑尼松組，但后者在尿IgG排出明顯少于中藥組，推測(cè)潑尼松組在保護(hù)腎小球分子篩屏障方面優(yōu)于中藥組。對(duì)實(shí)驗(yàn)家兔形態(tài)學(xué)上比較發(fā)現(xiàn)，中藥組和潑尼松組腎小球直徑與模型組相比有顯著差異，表明兩組藥物均能減輕腎小球肥大，潑尼松組更優(yōu)于中藥組。本實(shí)驗(yàn)西藥的治療效果得到了驗(yàn)證，但其副作用也明確體現(xiàn)出來(lái)，表明中藥復(fù)方對(duì)MN有一定治療效果，同時(shí)在改善全身一般狀態(tài)及減少副作用上優(yōu)于西藥。

本中藥復(fù)方系小柴胡湯加黃芪、靈芝、絞股藍(lán)、減半夏組成。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)小柴胡湯的藥理作用進(jìn)行了廣泛深入地研究，發(fā)現(xiàn)其具有糖皮質(zhì)激素樣作用，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，進(jìn)一步改善腎功能的作用〔6～9〕。MN是免疫性疾病同時(shí)其血栓和栓塞并發(fā)癥的發(fā)病率是腎病綜合征多種病理類型之冠。故我們?cè)谛〔窈鷾A(chǔ)上增加了黃芪、靈芝、絞股藍(lán)增加其免疫調(diào)節(jié)和降血脂作用〔10～19〕，觀察該方對(duì)MN治療效果。實(shí)驗(yàn)得到了我們預(yù)想結(jié)果，不僅明顯減少了免疫復(fù)合物形成和沉積而且具有明顯升高血ALB和降血脂作用，同時(shí)對(duì)GBM電荷屏障、分子篩屏障起一定的保護(hù)和修復(fù)作用。這種作用是該中藥降低腎病家兔尿蛋白的主要原因。推測(cè)該藥能中和血液中陽(yáng)離子因子，阻止其對(duì)GBM陰電荷的破壞。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為免疫功能紊亂、脂質(zhì)代謝紊亂、脂質(zhì)過(guò)氧化、自由基和腎小球內(nèi)凝血是腎炎發(fā)生、發(fā)展的重要因素。中藥復(fù)方可能亦通過(guò)影響這些因素治療、延緩MN進(jìn)展。

綜合分析本文資料，說(shuō)明中藥復(fù)方治療MN效果確切。它能抑制和減少免疫復(fù)合物形成并清除腎小球上皮下沉積的IC，減輕腎小球?yàn)V過(guò)膜損害，促進(jìn)GBM屏障的恢復(fù)，減少蛋白尿，其作用機(jī)制是多個(gè)方面的。本研究為這一中藥治療腎炎提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。