腫瘤甲基化抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷抑制人皮靜脈內皮細胞及生長因子受體2

陳涵 李鼎鵬 鄭先麗

(1甘肅省康復中心醫院，甘肅 蘭州 730030；2甘肅省中醫藥研究院；3甘肅中醫藥大學附屬醫院)

目前認為惡性腫瘤的發生是由多種因素導致的，這些自身基因和外在因素共同作用使人體細胞的DNA遭受非凋亡性損害，此過程會使潛在的致癌和抑制腫瘤滅活基因被激發，此時正常基因也會起到干預和阻滯作用，但在這過程中正常細胞逐漸發生癌性改變。我國惡性腫瘤每10萬人發生人數為285.91人，其中總體發病人群60歲以上超過3/5，城市發病率比農村高20%，而農村的死亡率卻比城市高8%〔1，2〕。

國家癌癥中心最新發布的包含了全國所有癌癥登記點的數據中指出，患病男性主要暴露因素為生活習慣、職業環境、各種壓力等相關因素〔3〕。而對于腫瘤的研究，諸多研究者發現血管生成與其緩慢發展和逐漸擴散關系非常緊密，當周徑<2 mm時，腫瘤只有原發部位的浸潤，呈潛伏性；當腫瘤>2 mm時，血管會逐漸形成，并伴隨轉移發生，新生血管的數目和增長速度決定了腫瘤的生長和擴散轉移程度，可見新生血管形成對其的重要性〔4〕。基于上述理論，目前對腫瘤治療藥物的研究熱點主要聚集在新生血管抑制劑上，腫瘤新生血管系統是由多種細胞參與的綜合復雜過程，但這個過程最初的形成是由血管內皮細胞(EC)進行的，因此對其進行最初的阻斷是阻止腫瘤生長的最初環節〔5〕。5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)可以與DNA甲基轉移酶結合，依靠活性降低來抑制甲基化基因，調節其表觀調控，抑制新生血管發生和分化，以此抑制腫瘤〔6〕。本研究從腫瘤擴散轉移的新生血管出發，通過發揮5-Aza-CdR去甲基化功能抑制其最初始的血管EC來防治腫瘤發生。

1 材料與方法

1.1試劑 人臍靜脈內皮細胞(HUVEC，貨號：120704491600)購于賽默飛世爾生物化學制品(上海)有限公司美國。DMEM高糖培養基(貨號：26406.02)、胎牛血清(貨號：F7305)、基質膠(貨號：526234)、胰蛋白酶(貨號：SH35042.01)購自GIBCO；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自武漢博士德生物科技有限公司(貨號：SH30256.01)；噻唑藍(MTT)粉(貨號：88417)、Transwell小室(貨號：CLS3583)和5-Aza-CdR(貨號：HPBIO163803)購自SIGMA公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(thermo fisher公司，貨號：T2234)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(貨號：WB0135)和超敏化學發光(ECL)試劑盒(貨號：WB0164)購自上海維奧生物科技有限公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自必拓生物(貨號：K12001S)。

1.2儀器 實驗室級純水系統(millipore，Milli-Q Integral)；超凈工作臺(蘇州億博，SZY3-12)；高速低溫冷凍離心機(GE，5804R)；CO2細胞培養箱(SANYO，SY-25)；-80℃超低溫冰箱(Eppendorf，M450)；光學顯微鏡(OLMPUS，BX60)；電熱數顯恒溫水浴鍋(北京長風儀器儀表公司，HH-8)；低速臺式離心機(北京醫用離心機廠，DS-2A)；垂直電泳儀(美侖，MH0430)；電轉移裝置(國藥集團化學試劑有限公司，SE600)。

1.3細胞培養 將HUVEC從液氮中取出放入提前預熱至37℃的水浴缽中，勻速晃動，直至完全溶解后放置于超凈工作臺進行操作。將廢液棄去，胰酶消化后，培養基吹打后，接種于培養瓶，用含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養，置于37℃，5% CO2的培養箱，72 h換液1次。在顯微鏡下觀察細胞活性，在無污染的情況下，當細胞鋪滿瓶壁時進行傳代，傳代時棄去廢液，吸取胰酶消化細胞，細胞皺縮快要脫落時棄去胰酶，加入DMEM培養基反復吹打，當細胞全部懸浮后分裝到各培養瓶中，再加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基進行培養。培養環境不變。各實驗均將細胞分為空白對照組、1、5、10 μmol/L 5-Aza-CdR藥物組(低、中、高劑量組)。

1.4MTT法檢測5-Aza-CdR對HUVEC細胞的增殖作用 當細胞傳至第3代時，取對數生長期HUVEC，按照傳代步驟消化后吹打成細胞懸液，在離心機中1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入DMEM培養基使HUVEC重懸，在細胞計數板中吸取10 μl細胞懸液，在倒置相差顯微鏡下觀察計數，將其濃度調整為1×105個/ml后在96孔板中接種，每孔吸入200 μl的懸液，每孔為2×104個，設置調零孔，檢測組每組10孔。每孔加入單純的含10%胎牛血清的DMEM培養液，為減少培養液的蒸發，在周圍孔每孔加入100 μl PBS。將96孔板置于CO2培養箱中過夜，然后棄上清，第1列含HUVEC培養孔和調零組的每孔加入無5-Aza-CdR的含10%胎牛血清的培養液。第2～4列孔中每孔分別加入5-Aza-CdR濃度為1、5、10 μmol/L的培養液100 μl。再次將96孔板置于培養箱中培養72 h，在24、48、72 h時各取出樣本檢測1次，棄廢液，PBS洗滌后，加入完全DMEM培養基，每孔再加入 10 μl MTT，濃度為5 mg/ml，孵育4 h，棄去每孔液體，再加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)，以1 500頻率震蕩10 min，融解結晶，在酶標儀上調零后，檢測各孔的吸光度值(A490值)。

1.5Transwell檢測5-Aza-CdR對HUVEC細胞的遷移作用 傳至第3代的細胞鋪滿培養瓶底時，用胰酶消化后加入完全DMEM培養基，混懸細胞，以1×105個/cm2密度接種于24孔的Transwell板上層培養小室中，每孔200 μl，在Transwell孔板下層培養小室中分別加入空白對照組完全培養液、1%含5-Aza-CdR的血清培養液、5%含5-Aza-CdR的血清培養液、10%含5-Aza-CdR的血清培養液，然后將其仍置于培養箱中，分別在24、48、72 h測細胞遷移。

1.65-Aza-CdR對HUVEC細胞管樣結構的形成作用 實驗檢測前1 d在超凈工作臺中鋪基質膠，從-20℃冰箱中取出冷凍的冰袋，紫外線消毒15 min，基質膠與DMEM培養基以1∶3的比例混勻后，以50 μl/孔加入96孔板，96孔板置于冰袋上，將其放入37℃恒溫箱中4 h后，轉至4℃冰箱中過夜。取對數生長期HUVEC，棄廢液，加入PBS沖洗1次后胰酶消化細胞，消化后加入完全培養基終止消化，吹打制備單細胞懸液并用細胞計數板分別計數。加入DMEM培養基將細胞稀釋為濃度2×104個/cm2，將細胞吸取加入到之前鋪好基質膠的96孔板中，置于37℃恒溫箱培養30 min后，分別加入10 μl含有5-Aza-CdR濃度為1、5、10 μmol/L的培養液，繼續放入培養箱中6 h后觀察小管形成并拍照。

1.7Western印跡檢測5-Aza-CdR對血管內皮生長因子受體(VEGFR)2的表達作用 細胞換液時各個培養瓶中分別加入含1、5、10 μmol/L 5-Aza-CdR的培養液，放入培養箱過夜后在檢測孔中加入2 ml 4℃的PBS后晃動洗滌1 min，棄去廢液后置于冰上，每孔加入裂解液100 μl，均勻來回搖動，裂解完成后用細胞刮刀收集，用移液器轉移至1.5 ml離心管中反復吹打。高速低溫冷凍離心機預冷4℃下離心10 min(12 000 r/min)后收集上清，-20℃保存備用。將裂解液A與裂解液B以50∶1比例混勻后加入BCA工作液，37℃恒溫箱過夜穩定。余步驟按照說明書操作后在酶聯免疫檢測儀(562 nm)檢測吸光值，計算出樣品中的蛋白濃度。據目標蛋白濃度，加入雙蒸水和5×上樣緩沖液后100℃滅活10 min，得到最終的蛋白樣品，配制的10%分離膠灌膠至綠帶中間線高度時即可，待濃縮膠凝固后加入電泳液，上樣量計算依據為檢測蛋白含量中含30 μg蛋白，同時加入蛋白Marker作為標記，以連續系統中上層濃縮膠的電泳電壓為恒壓90 V，分離膠電泳電壓為恒壓160 V進行電泳，完成后，在冰水中放入轉膜裝置并在295 mA條件下電泳1.5 h進行轉膜。加入抗體稀釋液的稀釋磷酸化兔抗人VEGFR2(1∶1 000)，封口，4℃搖動孵育過夜進行孵育抗體雜交，然后進行發光顯色。室溫孵育3 min后進行壓片曝光，掃描膠片后通過圖象處理系統分析目標帶凈光密度值。

1.8統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行Q檢驗、單因素方差分析、LSD檢驗、DunnettT檢驗。

2 結 果

2.15-Aza-CdR對HUVEC增殖的影響 高劑量組各時間點HUVEC的吸光度值顯著低于空白對照組和低劑量組(P<0.01)。低、中劑量組48、72 h的吸光度值顯著低于空白對照組(P<0.05)，且中劑量組72 h的吸光度值顯著低于低劑量組(P<0.05)；見表1。提示在時間程度上，時間長短與HUVEC的抑制程度呈正相關，而且在最大時間限度內藥物濃度越大對HUVEC的抑制作用越明顯。

2.25-Aza-CdR對HUVEC遷移的影響 不同濃度5-Aza-CdR在不同時間段能抑制HUVEC遷移，以高劑量組抑制效果最明顯。低、中、高劑量各時間點的HUVEC遷移均顯著小于空白對照組(P<0.01)。中、高劑量組各時間點的HUVEC遷移均顯著小于低劑量組(P<0.05,P<0.01)，見圖1，表2。

表1 培養不同時間點各組HUVEC增殖值)

與空白對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與低劑量組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

圖1 孵育24、48、72 h各組HUVEC遷移情況(臺盼藍染色，×200)

表2 不同培養時間各組HUVEC遷移

2.35-Aza-CdR對HUVEC細胞管樣結構形成的作用 不同濃度5-Aza-CdR在一定時間段內對HUVEC細胞小管形成影響不同，小管形成能力隨5-Aza-CdR濃度的降低而增加(圖2)。細胞接種6 h后在基質膠上排列形成類似于毛細血管的完整管腔。在不同濃度5-Aza-CdR作用下，HUVEC細胞成團聚集，基質膠上完整的管腔結構與空白對照組相比顯著減少。與空白對照組比較，各劑量組小管形成完整的管腔結構顯著減少；低劑量組6 h后管腔結構被破壞，不時有斷裂出現，呈現一種不完整的、稀疏的網狀結構；中劑量組細胞管腔結構破壞嚴重，斷裂擴大，細胞不再聚集開始分散，網狀結構明顯；高劑量組幾乎沒有發現完整閉合的管腔形成，5-Aza-CdR對HUVEC細胞形成管腔能力的抑制作用則更明顯。提示，不同濃度5-Aza-CdR均可降低HUVEC小管形成能力，使小管周徑變小、成環率降低，高劑量組抑制作用最明顯。

圖2 各組HUVEC細胞管樣結構生成活性(Brdu,×200)

2.45-Aza-CdR對細胞VEGFR2表達的作用 隨含藥濃度增加，細胞內VEGFR2蛋白表達降低，見圖3。5-Aza-CdR可以明顯抑制VEGFR2蛋白表達，并與劑量濃度大小有正相關關系，濃度越大其抑制蛋白表達的作用也越明顯。

圖3 5-Aza-CdR干預HUVEC 24 h后VEGFR2表達

3 討 論

血管生成是腫瘤血管形成的經典方式，它是原有血管在腫瘤細胞分泌的各種促血管生長因子的作用下，經過一系列降解、EC增殖遷移導致形成新生血管的過程。雖然部分腫瘤的發生可以不伴有血管形成，但是因為其最初的原位癌有潛在漫長的休眠期，此時期腫瘤體積很小只有幾立方毫米，但當足夠數量的細胞從休眠表型轉變為血管化表型時，便會快速生長并會有轉移〔7〕。Folkman等〔8〕首次提出血管生成對于腫瘤生長和轉移的重要性，并由此推斷抑制腫瘤生長的有效措施可以是阻斷血管生成，在此機制中把腫瘤生長發生的機制歸結為腫瘤本身和依存的環境致使血管生成，主要是EC被刺激活化使拮抗因子平衡失調導致的過程，尤其會導致加速擴散增殖。此策略觀點被后來的學者接受，并一致認為腫瘤血管生成中EC的不斷增殖和遷移是極為重要的環節，并針對此機制研發了抑制EC的藥物，以此抑制腫瘤血管的生成。煙曲霉類似物TNP-470便是典型的腫瘤血管抑制劑，在臨床各種實體惡性腫瘤的遷移驗證中取得了較好的療效〔9〕。研究證明EC通過增加自身的血管生成或增加腫瘤細胞遷移到細胞外基質的侵襲能力來調節腫瘤細胞的侵襲能力〔10〕。而且研究已充分證明此種以EC為靶點來抵抗血管新生來抑制腫瘤細胞增殖是可行性極高的方式〔11〕。其主要表現為首先在腫瘤細胞刺激下的EC功能變化引起相關生化指標的變化可通過血液系統獲得直接體現，有利于腫瘤的早期預測；其次，EC也是腫瘤藥物治療時最先到達的靶細胞。

研究發現，非小細胞肺癌化療時采用5-Aza-CdR進行輔助可以改善藥敏降低，使細胞受到抑制和凋亡〔12〕。腫瘤血管的發生從單一細胞增殖開始逐漸發展為大量細胞增殖，新生血管會在原有基礎上快速增殖，通過細胞的不斷增殖來為HUVEC提供源源不斷的營養，而HUVEC反過來又會分泌多種物質來促進這個過程的加快，因此，抗血管生成首先就要抑制細胞增殖〔13〕。本研究提示，5-Aza-CdR在參與抑制血管生成過程的機制之一可能是抑制細胞增殖而起作用。

以含藥血清干預HUVEC來抑制其增殖和遷移使血管難以或者延遲生成，是依靠EC的黏附力降低以使EC損傷加快誘發腫瘤血管新生和轉移〔14，15〕。由此可見，腫瘤的發生和轉移中血管生成起到很大的作用，抑制此過程將是治療的一個有效措施。本研究提示5-Aza-CdR可能是抑制細胞遷移而阻滯血管生成來防治腫瘤的發生。

腫瘤的血管形成過程是增殖-遷移-血管形成〔8〕。血管生成的過程雖然復雜，但是其主要途徑之一便是EC的活化、增殖和遷移，最后形成管樣結構，在管樣結構形成的基礎上，再由多個血管芽相互連接形成血管網狀結構〔16〕。因此，抑制血管形成中的管樣結構，使其難以形成網狀結構是阻滯腫瘤發生的重要步驟。本研究表明，5-Aza-CdR可顯著抑制HUVEC的管腔形成。

不論是原發性還是轉移性的腫瘤均有內部因子失控的發生〔17〕。腫瘤在快速生長和侵襲周圍環境時需要較多的營養和有氧化條件，當所在血管不能滿足發展時會激發腫瘤細胞生成促進血管新生的因子，來改變局部環境利于其生長。在此過程中因為這些分泌的因子，EC會快速增殖、芽生，迅速形成管腔，以此建立連接功能性血供網為腫瘤提供充足的養分〔18〕。EC在新生血管的前端持續遷移以便于競爭頂端細胞，而這種趨勢需要細胞內環境信號的依賴〔19〕。通過腫瘤血管中EC前期研究，發現促進EC遷移是多種因子作用的結果，這些因子與其相應的受體及靶細胞結合以此促進遷移，來誘導血管新生，使腫瘤發生轉移，其中血管內皮生長因子(VEGF)便是影響EC遷移最重要的因子〔20〕。VEGF通過激活細胞外信號調節激酶和絲裂原活化蛋白激酶信號轉導途徑引起EC增殖和遷移。內皮頂端細胞在胞外VEGF誘導下，高表達的VEGFR2促使HUVEC更易于占據頂端位置〔21〕。而5-Aza-CdR還能干擾VEGFR2降低細胞能動性，使作為血管生成因子在腫瘤血管生成中具有強大調節性的最活躍和最強特異性的VEGF受到阻滯，抑制腫瘤的形成、轉移。本研究發現VEGFR2蛋白表達量顯著下降，其蛋白下降的程度與藥物濃度呈正比。

本課題組在前期研究的基礎發現5-Aza-CdR作為一種特異性甲基轉移酶抑制劑能夠抑制血液惡性腫瘤和多種實體腫瘤細胞，有著廣譜抗腫瘤的作用〔22〕。因此，充分利用其抗腫瘤的廣譜性質和去甲基化的作用，結合分子生物學研究藥物途徑抑制HUVEC的增殖、遷移、小管形成和血管因子受體蛋白的作用和表達，達到有效、安全、快速抑制惡性腫瘤細胞和治療腫瘤的目的，在目前的醫療水平階段有重要意義，是一種應用前景良好且有效的抗腫瘤藥物。