唑尼沙胺對PS1/APP小鼠學習記憶功能和前額葉皮層中BDNF和TrkB的影響

周儒奎 劉晉芳 楊李旺 牛曉軍 儲開博 武赟 翟曉艷

(山西中醫藥大學基礎醫學院，山西 晉中 030621)

阿爾茨海默病(AD)是一種在老年人群中經常出現的神經退行性疾病，其主要的臨床特征是漸進性發展的認知功能障礙，特別是進行性記憶功能受損，最終導致癡呆〔1〕。腦源性神經營養因子(BDNF)是一種對學習和記憶功能極其重要的神經營養因子〔2〕，通過連接它的主要受體酪氨酸激酶受體(Trk)B在神經元的生長、生存、分化過程中發揮重要作用，維持神經元的正常功能和突觸可塑性，從而維護中樞神經系統的正常功能，而在AD患者大腦皮層和海馬中BDNF和TrkB的表達減少，參與了AD的記憶功能缺陷病理機制中〔3，4〕。

唑尼沙胺(ZNS)可以通過血腦屏障到達神經系統，一直以來作為一種抗癲癇的藥物來使用并且沒有什么副作用〔5〕，同時ZNS可以改善帕金森病患者的主要癥狀〔6〕。研究表明ZNS可以通過抑制小膠質細胞的活性和抗氧化作用起到神經保護作用〔7〕，在周圍神經損傷研究中發現，ZNS可以通過促進BDNF和TrkB的表達，來促進運動神經元神經突伸長和軸突的再生〔8〕。目前關于ZNS對AD中BDNF和TrkB的變化調節來改善學習記憶功能的研究國內外尚未見報道，本實驗擬觀察對PS1/APP小鼠學習記憶功能和前額葉皮質BDNF和TrkB的影響，探討ZNS在AD治療中的可能作用及作用機制。

1 材料和方法

1.1材料 Morris水迷宮設備(中國醫學科學院研制)；ZNS(TCI上海化成有限公司)；綿羊多克隆BDNF抗體、兔多克隆TrkB體(Abcam司)，小鼠多克隆GAPDH抗體(中杉金橋公司)，HRP標記兔抗綿羊IgG(康維生物公司)，HRP標記山羊抗兔IgG(中杉金橋公司)，蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich公司)，蛋白裂解液、BCA試劑盒、ECL Plus發光液(碧云天生物公司)，DAB染色劑(中杉金橋生物公司)。

1.2實驗動物及分組 PS1/APP雙轉基因小鼠14只和野生C57L/6J小鼠7只，體重20～30 g，6月齡，小鼠飼養在24℃左右通風良好的房間，維持相對濕度在60%左右，每天12 h光照環境，給予清潔的飲水和飼料，14只PS1/APP小鼠隨機平均分為兩組，分別為生理鹽水(PS1/APP-veh)組、ZNS(PS1/APP-ZNS)組，7只野生C57/BL6J小鼠作為野生生理鹽水(WT-veh)組，給藥采取腹腔注射，分別每天注射20 mg/kg生理鹽水、20 mg/kg ZNS、20 mg/kg生理鹽水，所有小鼠加藥4 w。

1.3Morris水迷宮行為學測試

1.3.1定位航行實驗 在加藥4 w后，利用水迷宮評估小鼠的空間記憶，先做定位航行試驗測試，其中環狀水池，黑色，水池劃分為四個象限，在第二象限放置直徑為8 cm的平臺，注水，將水溫調節在(24±1)℃，使水位高于平臺2 cm。設置每次檢測的時間為60 s，小鼠放入水中時，面向箱壁邊緣，60 s內讓小鼠在水下尋找平臺，當小鼠尋找到平臺并在平臺逗留超過2 s后，錄像自動停止，記錄下每只小鼠的潛伏期時間(從入水至停留到平臺的時間)，當小鼠在水下尋找平臺時間超過60 s時，人為地引領小鼠至平臺，繼續讓小鼠在平臺上逗留大約10 s，記錄時間為60 s。每天讓每只小鼠先后依次從劃分的四個象限固定位置入水，持續5 d，撤去平臺。

1.3.2空間探索實驗 第6天測試時，從水迷宮中取出水下的平臺，讓小鼠從第四象限入水，讓其在水中游泳60 s，記錄小鼠游過原先放置平臺位置的次數。

1.4免疫組化檢測BDNF和TrkB在前額葉的表達 各組小鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，左心室注射4%多聚甲醛灌流固定，取出腦組織，放于4%的多聚甲醛中過夜固定，再依次用20%蔗糖溶液、25%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液處理后，使用恒冷冰凍切片機切片，厚度為7 μm，切好的冰凍切片置于-20℃冰箱保存備用。切片在室溫放置1 h，用過氧化物酶室溫孵育10 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次；分別用兔血清和山羊血清孵育各組切片15 min，棄血清，滴加羊BDNF抗體和兔TrkB抗體，濃度均為1∶100，4℃過夜；次日PBS洗3次，各組切片分別滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗羊二抗和羊抗兔二抗，室溫孵育15 min，PBS洗3次，滴加生物鏈霉素，室溫孵育15 min；二氨基連苯胺(DAB)呈色，PBS水洗，常規脫水、透明，用中性樹膠封片。

1.5Western印跡檢測BDNF和TrkB在前額葉皮層的表達 各組小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，小鼠斷頭取腦，分離出前額葉皮層；將前額葉皮層置于裝有蛋白裂解酶和蛋白酶抑制劑的離心管中，超聲粉碎后放于4℃過夜，次日4℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量；煮樣，分裝、-80℃凍存備用；等量樣品加入到8%十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠中，轉移至聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜，將膜放入5%小牛血清(BSA)封閉2 h后，按蛋白分子量裁膜，加入1∶1 000稀釋的兔多克隆TrkB抗體、1∶2 000稀釋的羊多克隆BDNF、1∶2 000稀釋的兔多克隆GAPDH，放于4℃冰箱過夜，TBST洗膜后，加入相應經稀釋1∶5 000 HRP標記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G和兔抗羊IgG，37℃孵箱孵育2 h后，TBST洗膜，經電化學發光(ECL)，Bio-Rad凝膠成像系統采圖，Image J軟件分析。

1.6統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗，方差分析。

2 結 果

2.1Morris水迷宮行為學測試結果 在定位航行試驗中，隨著訓練次數增加，各組小鼠找到水下平臺的時間縮短，PS1/APP-veh組小鼠較WT-veh組小鼠需消耗更長時間找到水下平臺(P<0.05)；PS1/APP-ZNS組較PS1/APP組小鼠找到水下平臺的時間縮短(P<0.05)；空間探索試驗中，PS1/APP-veh組小鼠較WT-veh組小鼠穿越原平臺位置次數減少(P<0.05)；PS1/APP-ZNS組小鼠較PS1/APP-veh組小鼠穿越原平臺位置次數增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間水迷宮行為學測試結果比較

與WT-veh組比較：1)P<0.05；與PS1/APP-veh組比較：2)P<0.05，下表同

2.2免疫組化分析BDNF蛋白和TrkB蛋白在前額葉皮層的表達 鏡下觀察到WT-veh組前額葉區BDNF和TrkB陽性反應產物呈棕褐色，與WT-veh組相比，PS1/APP-veh組BDNF和TrkB陽性反應產物著色變淺，陽性細胞數減少，積分光密度明顯減少(P<0.05)；與PS1/APP-veh組相比，PS1/APP-ZNS組BDNF和TrkB的陽性反應產物變深，陽性細胞數增多，積分光密度明顯增多(P<0.05)。該實驗證實PS1/APP小鼠較正常小鼠前額葉皮層中出現BDNF和TrkB水平的下降，注射ZNS可以促進PS1/APP小鼠前額葉皮層中BDNF和TrkB的表達。見圖1，表2。

箭頭表示陽性細胞圖1 各組前額葉中BDNF與TrkB的表達(免疫組化，×200)

表2 各組前額葉中BDNF與TrkB積分光密度比較

2.3Western印跡方法觀察前額葉皮層BDNF蛋白和TrkB蛋白表達 PS1/APP-veh組較WT-veh組前額葉皮層中BDNF和TrkB水平減少(P<0.05)，PS1/APP-ZNS組較PS1/APP-veh組前額葉皮層中BDNF和TrkB水平增多(P<0.05)。該實驗也證實PS1/APP小鼠中較正常小鼠前額葉皮層中BDNF和TrkB水平的下降，注射ZNS可以促進PS1/APP小鼠前額葉皮層中BDNF和TrkB的表達。見表3，圖2。

1～3：WT-veh組、PS1/APP-veh組、PS1/APP-ZNS組圖2 Western印跡顯示各組前額葉中BDNF和TrkB的表達

表3 各組前額葉中BDNF與TrkB蛋白表達比較

3 討 論

AD主要的表現是學習記憶功能衰退和其他認知能力的下降，并且病人通常伴有一定程度的精神和行為障礙〔9〕。PS1/APP小鼠能夠模擬AD的主要病理生理機制，出現相似的學習記憶功能障礙等癥狀，是公認的比較好的AD模型〔10〕。

ZNS主要通過抑制鈉離子通道和T型鈣通道、間接抑制谷氨酸受體的活性從而增強抑制型神經遞質γ-氨基丁酸(GABA)的釋放來起到抗癲癇的作用〔11〕，在帕金森病中ZNS可以對多巴胺細胞起到神經保護作用〔12，13〕，在腦損傷中ZNS也可以起到神經保護的作用〔14〕，在周圍神經損傷研究中發現，ZNS可以通過促進BDNF和TrkB的表達來促進運動神經元神經突伸長和軸突的再生〔15〕。

在大腦發育過程中，BDNF作為一種生長因子，能夠促進神經元突觸中軸突、樹突的生長和成熟，有利于增強突觸的可塑性，在學習和記憶過程中起到重要的促進作用〔16〕。BDNF通過與TrkB作用，激活三大信號通路，包括增殖蛋白激酶-細胞外調節蛋白激酶(MEKs-ERK)、磷酯酶Cγ1-三磷酸肌醇/二酰基甘油(PLCγ1-IP3/DAG)和磷脂酰基醇激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路，這些通路對突觸生長和突觸的可塑性有重要作用〔17，18〕。BDNF通過增加神經元樹突棘的數目和大小促進軸突的形成，BDNF與TrkB結合，可以激活ERK和PI3K途徑，促進突觸相關蛋白突觸小泡蛋白(SYP)、生長相關蛋白(GAP)-43和突觸后致密蛋白(PSD)95的表達〔19〕。Marchetti〔20〕認為BDNF和TrkB的減少會降低突觸可塑性，損傷神經元，是前額葉皮層和海馬退行性變化的主要原因。前額葉皮層是人類大腦高級認知活動相關的關鍵區域，在注意力、情緒調節、學習記憶過程和思維推理中起重要作用〔21〕。向AD小鼠模型注入BDNF可以改善前額葉皮層和海馬的退行性變化和改善其學習和記憶功能〔22〕。

本研究結果表明ZNS可以通過促進前額葉皮層內BNDF和TrkB的表達，有利于突觸相關蛋白的表達和增強突觸的可塑性，從而改善PS1/APP小鼠中的學習和記憶功能。