lncRNA PCAT19靶向miR-143-3p通過信號通路PI3K/Akt對甲狀腺癌細胞增殖和凋亡的影響及機制

陳超 張偉麗 馮長松

(信陽職業技術學院醫學院，河南 信陽 464000)

甲狀腺癌是一種常見的內分泌惡性腫瘤，其發病機制復雜，從分子層面研究、了解甲狀腺癌的發病機制有助于甲狀腺癌患者的個體精準化治療〔1〕。研究發現長鏈非編碼RNA(lncRNA)在多種類型癌癥中的失調表達與癌癥的發生發展相關，然而它們在甲狀腺癌中的作用和分子機制仍不完全清楚〔2〕。前列腺癌相關轉錄本(PCAT)是一種lncRNA，PCAT1與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲轉移及患者的預后密切相關〔3〕。PCAT19是PCAT家族成員之一，有研究發現長同型PCAT19調節細胞增殖、生長和轉移，可通過lncRNA PCAT19驅動前列腺癌的進展〔4〕；此外，PCAT19通過調節miR-182/丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)4和代謝平衡促進喉癌細胞的增殖和腫瘤發生〔5〕。研究發現，多種miRNA在不同類型的甲狀腺癌中表達異常，表明miRNA可能在甲狀腺癌的發生、發展過程中有重要作用〔6〕。研究報道miR-143-3p通過靶向RNA結合蛋白quaking(QKI)-5在食管鱗狀細胞癌中調節細胞增殖、侵襲和上皮-間質轉化，起到抑制腫瘤的作用〔7〕。miR-143-3p通過調節絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)7的表達抑制人乳腺癌細胞的增殖，遷移和侵襲〔8〕。miR-143-3p在甲狀腺乳頭癌中下調表達，但作用機制不清楚〔9〕。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號轉導通路是細胞內重要的信號轉導通路之一，也是甲狀腺癌中一條重要的信號傳導通路，與甲狀腺癌的發生發展相關〔10〕。有研究發現干擾胰島素受體底物(IRS)-1通過抑制PI3K/AKT信號通路激活能降低人乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細胞的生存能力和轉移能力〔11〕。然而PCAT19及miR-143-3p對甲狀腺癌細胞增殖和凋亡的影響及其機制尚不清楚，本實驗旨在研究PCAT19及miR-143-3p對甲狀腺癌細胞增殖和凋亡的影響及PCAT19是否通過調控miR-143-3p和PI3K/AKT信號通路影響甲狀腺癌細胞增殖和凋亡。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑 甲狀腺癌細胞BCPAP、TPC-1、SW1736和正常甲狀腺細胞HT-ori3均購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、RPMI-1640培養基購自上海玉博生物科技有限公司；Trizol試劑、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自上海君瑞生物技術有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；MTT試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠(Annexin V-FITC/PI)試劑盒購自上海一研生物科技有限公司。

1.2細胞培養 將甲狀腺癌細胞BCPAP、TPC-1、SW1736和正常甲狀腺細胞HT-ori3置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，在37℃、5% CO2的培養箱中培養，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3細胞轉染與分組 取對數生長期甲狀腺癌細胞BCPAP，將miR-con、miR-143-3p、si-con、si-PCAT19、pcDNA和pcDNA-PCAT19質粒分別轉染至BCPAP細胞中，記為miR-con組、miR-143-3p組、si-con組、si-PCAT19組、pcDNA組和pcDNA-PCAT19組；未進行任何處理的甲狀腺癌細胞BCPAP作為對照(NC)組；將si-PCAT19分別與anti-miR-con和anti-miR-143-3p質粒共轉染至BCPAP細胞中，分別記為si-PCAT19+anti-miR-con組和si-PCAT19+anti-miR-143-3p組，轉染均按照LipofectamineTM 2000試劑盒進行操作。

1.4qRT-PCR檢測miR-143-3p和PCAT19表達水平 用Trizol提取細胞總RNA，RNA定量后反轉錄成cDNA，按照PCR試劑盒以β-actin為內參進行PCR擴增，反應條件：95℃ 5 min；95℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環。相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.5Western印跡檢測細胞周期蛋白(Cyclin)D1、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)-3、磷酸化(p)-AKT、磷脂酰肌醇3-激酶的P110α催化亞基(PI3Kp110α)蛋白表達 提取細胞總蛋白，檢測蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后將蛋白樣品轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉液室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，加入二抗(1∶2 000)孵育2 h，曝光顯影、定影、用Quantity One軟件檢測蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和內參β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.6MTT檢測細胞存活率 細胞培養48 h，加入20 μl MTT溶液，繼續孵育4 h；加入 DMSO振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細胞增殖存活率(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.7流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞后用預冷的PBS，結合緩沖液重懸細胞，依次加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育15 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

1.8熒光素酶報告基因實驗檢測PCAT19對miR-143-3p的靶向調控 構建含miR-143-3p結合位點的PCAT19野生型和突變型熒光素酶表達載體(WT-PCAT19和MUT-PCAT19)，將其分別與miR-con和miR-143-3p共轉染至BCPAP細胞中。按說明書檢測熒光素酶活性，實驗重復3次。

1.9統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1甲狀腺癌細胞系中lncRNA PCAT19和miR-143-3p的表達 HT-ori3相比，BCPAP、TPC-1、SW1736中PCAT19 mRNA的表達水平顯著升高，miR-143-3p的表達水平顯著降低(P<0.05)。可見，在甲狀腺癌細胞系中，lncRNA PCAT19高表達，miR-143-3p低表達。見表1。

表1 甲狀腺癌細胞和正常甲狀腺細胞系中lncRNA PCAT19和miR-143-3p的表達

與HT-ori3比較:1)P<0.05

2.2敲低PCAT19抑制甲狀腺癌BCPAP增殖，誘導凋亡 與NC組及si-con組相比，si-PCAT19組PCAT19、CyclinD1表達水平顯著降低，Cleaved-caspase-3表達水平顯著升高(P<0.05)，BCPAP細胞存活率顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖1、圖2、表2。可見，敲低PCAT19抑制與BCPAP細胞增殖，促進細胞凋亡。

圖1 CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達

NC組、si-con組、si-PCAT19組圖2 流式細胞儀檢測細胞凋亡

表2 敲低PCAT19抑制甲狀腺癌BCPAP增殖，誘導凋亡

與si-PCAT19組比較：1)P<0.05

2.3高表達miR-143-3p抑制BCPAP增殖，誘導凋亡 與miR-con組相比，miR-143-3p組miR-143-3p、Cleaved-caspase-3表達水平顯著升高，CyclinD1表達水平顯著降低(P<0.05)，細胞存活率顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。可見，高表達miR-143-3p抑制BCPAP細胞增殖，促進細胞凋亡。見圖3、表3。

圖3 NC組、miR-con組、miR-143-3P組CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達

表3 高表達miR-143-3p抑制BCPAP甲狀腺癌細胞增殖，誘導凋亡

與miR-con組比較：1)P<0.05

2.4lncRNA PCAT19靶向miR-143-3p表達 通過starbase在線軟件預測到PCAT19與miR-143-3p存在結合位點(圖4)。轉染野生型PCAT19表達載體后，相較于miR-con組，miR-143-3p組甲狀腺癌細胞BCPAP的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉染突變型PCAT19表達載體后，甲狀腺癌細胞BCPAP的熒光素酶活性差異不顯著。見表4。相較于pcDNA組(0.35±0.05)，pcDNA-PCAT19組(0.10±0.02)，miR-143-3p的表達水平顯著降低；相較于si-con組(0.32±0.03)，si-PCAT19組miR-143-3p的表達水平顯著升高(3.88±0.39，P<0.05)。可見，PCAT19可靶向調控miR-143-3p的表達。

圖4 通過starbase對PCAT19和miR-143-3p結合進行預測

表4 miR-con或miR-143-3p與報告質粒共轉染BCPAP細胞后雙熒光素酶活性檢測

2.5miR-143-3p低表達可以部分逆轉PCAT19低表達對BCPAP增殖和凋亡的影響 與si-PCAT19+anti-miR-con組相比，si-PCAT19+anti-miR-143-3p組miR-143-3p表達水平顯著降低(P<0.05)，CyclinD1表達水平顯著升高，Cleaved-caspase-3表達水平顯著降低(P<0.05)，細胞存活率顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5、表5。可見，miR-143-3p低表達可以部分逆轉PCAT19低表達對BCPAP增殖抑制和凋亡促進的作用。

2.6PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達 與si-con組相比，si-PCAT19組p-AKT、PI3Kp110α表達水平顯著降低；與si-PCAT19+anti-miR-con組相比，si-PCAT19+anti-miR-143-3p組p-AKT、PI3Kp110α表達水平顯著升高(P<0.05)。可見，敲減PCAT19可以抑制PI3K/AKT信號通路p-AKT、PI3Kp110α的表達，而miR-143-3p低表達可以部分逆轉PCAT19低表達對p-AKT、PI3Kp110α的表達的抑制作用。見表5、圖6。

1～4:si-con組;si-PCAT19組;si-PCAT19+anti-miR-con組;si-PCAT19+anti-miR-143-3p組；圖6同圖5 各組CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達

表5 miR-143-3p低表達對細胞增殖、侵襲和遷移及相關蛋白表達的影響

與si-con組比較：1)P<0.05；與si-PCAT19+anti-miR-con組比較：2)P<0.05

圖6 Western印跡檢測p-AKT和PI3Kp110α的表達

3 討 論

甲狀腺癌近年來發病率逐漸升高，嚴重危害人類健康，研究可用于甲狀腺癌診斷和預后預測的生物標志物及治療靶點，對臨床具有重要意義〔12〕。lncRNA 和miRNA均屬于非編碼RNA，參與甲狀腺癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移等過程，可作為甲狀腺癌診斷、預后的標志物及治療靶點〔13,14〕。PCAT1、PCAT7與PCAT19同屬PCAT家族，有研究報道PCAT-1過表達通過調節細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKN)1A促進胃癌細胞的增殖和轉移〔15〕；PCAT-1還促進前列腺癌細胞增殖和侵襲，并且與前列腺癌患者的不良預后相關〔16〕；PCAT19也促進前列腺癌進展〔4〕。過表達PCAT7通過抑制miR-134-5p可促進非小細胞肺癌細胞增殖，抑制細胞凋亡，促進細胞轉移〔17〕。以上結果表明上調表達的PCAT均促進腫瘤的進展，本實驗結果顯示，PCAT19在甲狀腺癌細胞中與上調表達，敲低PCAT19可抑制Cyclin D1蛋白的表達，促進Cleaved-caspase-3蛋白的表達；抑制甲狀腺癌細胞BCPAP增殖，促進細胞凋亡。且PCAT19靶向負調控miR-143-3p。

有研究報道沉默lncRNA肺癌轉移相關轉錄本(MALAT)1可通過miR-143-3p調節鋅指E-box結合同源異型盒轉錄因子(ZEB)1表達進而抑制肝癌細胞增殖和侵襲〔18〕。在宮頸癌組織和細胞系中miR-143-3p低表達，敲低lncRNA HOX反義基因組RNA(HOTAIR)通過上調miR-143-3p能抑制宮頸癌細胞的增殖、促進細胞凋亡〔19〕。miR-143-3p在創傷后增生性瘢痕組織和成纖維細胞中也顯著下調表達，miR-143-3p通過AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑靶向結締組織生長因子(CTGF/CCN2)可抑制增生性瘢痕形成〔20〕。以上結果表明，miR-143-3p可被lncRNA調控進而影響腫瘤的進展，且其也可以靶向調控下游信號通路或靶基因而影響腫瘤的發生發展。本實驗研究結果顯示，miR-143-3p在甲狀腺癌細胞中也呈低表達，過表達miR-143-3p抑制CyclinD1蛋白的表達，促進Cleaved-caspase-3蛋白的表達；抑制甲狀腺癌細胞BCPAP增殖，促進細胞凋亡。且miR-143-3p受lncRNA PCAT19的靶向調控，miR-143-3p低表達可部分逆轉PCAT19低表達對BCPAP細胞增殖抑制和凋亡促進的作用；還逆轉了PCAT19低表達對p-AKT和PI3Kp110α的抑制作用。

AKT和PI3Kp110α是PI3K/AKT信號通路中的作用分子，PI3K/AKT信號轉導通路的活化可使甲狀腺細胞異常增殖，促進甲狀腺結節的發生、發展〔21〕。研究發現PI3K抑制劑通過抑制p-AKT的表達可抑制甲狀腺未分化癌HTH-15細胞增殖，促進細胞凋亡，降低細胞侵襲能力〔22〕。下調PI3K/AKT信號通路可抑制甲狀腺癌細胞的侵襲〔23〕；通過抑制甲狀腺癌細胞中PI3K/AKT途徑可增強TNF相關凋亡誘導配體(TRAIL)誘導的細胞凋亡〔24〕。以上結果均表明PI3K/AKT信號通路在甲狀腺癌中起致癌作用，抑制該通路的激活可抑制甲狀腺癌的進展。本實驗中敲低PCAT19抑制甲狀腺癌細胞BCPAP增殖，促進細胞凋亡。且敲低PCAT19抑制p-AKT和PI3Kp110α的表達，即抑制PI3K/AKT信號通路的激活；此外，miR-143-3p低表達可逆轉PCAT19低表達對p-AKT和PI3Kp110α的抑制作用。提示PCAT19可能通過miR-143-3p進而調控PI3K/AKT信號通路，從而影響甲狀腺癌細胞增殖和凋亡。

綜上所述，lncRNA PCAT19可抑制甲狀腺癌細胞增殖，促進其凋亡，其機制可能與miR-143-3p及PI3K/AKT信號通路有關，將可為甲狀腺癌的預防、治療和預后提供新的生物標志物和新靶點。