血漿外泌體miR-29c在血管性認知障礙患者中的表達及意義

趙維納 孫文強 賀夢菲 譚琳 尹昌浩 孫麗 王加良

(1牡丹江醫學院附屬紅旗醫院神經內科，黑龍江 牡丹江 157000；2牡丹江醫學院；3牡丹江醫學院附屬紅旗醫院藥學部)

隨著我國人口老齡化的加快，血管性認知障礙(VCI)的發病率逐年升高，尤其是血管性癡呆已占全部癡呆人群的36%，VCI包括從輕度認知功能受損到癡呆的各種程度的認知功能障礙〔1〕。輕度認知功能受損癥狀較輕，易忽視，但發展至中晚期的治療效果不甚理想，極大增加治療的困難性，嚴重影響老年人的生存質量和身心健康，因此，VCI的早期診斷和干預對VCI 治療具有積極的臨床意義〔2〕。miRNA是一類參與機體發育、基因轉錄調節、神經突觸形成、細胞增殖、分化和凋亡過程中的非編碼單鏈核酸小分子〔3〕。miR-29家族與缺血或缺氧引發的炎癥反應相關的VCI發生、發展有重要關系〔4〕，但血漿外泌體miR-29c在VCI中的表達和作用尚不明確，本研究擬探討血漿外泌體miR-29c在VCI患者中的表達水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1基礎資料 經醫院倫理委員會批準，牡丹江醫學院附屬紅旗醫院2018年3～8月收治的68例VCI患者為觀察組，另選取65例健康志愿者為健康組，觀察組男38例，女30例；年齡55～77歲，平均(63.27±7.54)歲；VCI非癡呆35例，血管性癡呆11例，混合型癡呆22例；受教育年限6～16年，平均(10.75±1.84)年。健康組男34例，女31例，年齡54～75歲，平均(62.73±7.21)歲；受教育年限5～16年，平均(11.26±1.96)年。兩組基礎資料差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：①觀察組符合《血管性認知障礙診治指南》VCI診斷標準〔5〕，影像學檢查結果顯示存在腦血管病變灶，且存在認知障礙；②均簽署知情同意書。排除標準：①甲減、梅毒性血管炎、維生素(Vit)B12缺乏所致的認知障礙者；②存在精神障礙者；③合并嚴重代謝性疾病、惡性腫瘤者；④嚴重視聽和語言障礙者。

1.2研究方法 (1)采用實時熒光定量聚合鏈式反應(qRT-PCR)檢測兩組血漿外泌體miR-29c的表達水平：①采集所有研究對象血液樣本，1 500 r/min離心5 min，收集血漿；②外泌體提取試劑盒(Norgen Biotek公司)提取外泌體；③外泌體RNA提取試劑盒(Norgen Biotek公司)提取和純化外泌體小RNA；④反轉錄得到cDNA，利用qRT-PCR儀(瑞士Roche，型號：cobas z480)進行擴增，引物合成(上海生工)，上游引物：5'-CCAGCGTGTAGCACCATTT-3'，下游引物：5'-AGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'，反應條件：95℃，30 min；95℃，25 s；63℃，30 s；72℃，25 s；35個循環，AceQqPCRSYBR?GreenMix(南京vazyme，貨號：Q221-01)，以U6為內參。采用2-ΔΔCt法定量分析血漿外泌體miR-29c表達水平。

(2)采用蒙特利爾認知評估量表(MoCA)評價兩組認知功能，包括注意(3分)、語言(5分)、執行(3分)、記憶(6分)、視結構技能(4分)、計算力(3分)和地點定向力(6分)，評分0～30分，分值越高，表示患者認知功能越良好。

(3)于清晨空腹抽取肘部血液5 ml，3 000 r/min離心10 min，收集血清，通過酶聯免疫吸附試驗檢測同型半胱氨酸(Hcy)、C反應蛋白(CRP)、葉酸(FA)、VitB12，最后酶標儀(美國Bio-Rad，型號：680)上樣檢測并分析血漿外泌體miR-29c表達量與MoCA評分、血清中Hcy、CRP、FA和VitB12水平的相關性。

1.3統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行t檢驗、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1兩組血漿外泌體miR-29c水平 觀察組血漿外泌體miR-29c表達水平(4.64±0.33)顯著高于健康組(2.72±0.15，t=42.861,P=0.000)。

2.2兩組認知功能評分比較 觀察組MoCA總評分及注意、語言、執行、記憶、計算力、定向力、視結構技能評分均顯著低于健康組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3兩組VCI指標比較 觀察組Hcy、CRP水平顯著高于健康組(P<0.05)，FA和VitB12水平顯著低于健康組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.4觀察組血漿外泌體miR-29c表達量與VCI指標的相關性 血漿外泌體miR-29c表達量與MoCA評分、FA、VitB12水平均呈負相關(r=-0.705、-0.718、-0.815，P=0.001、0.000、0.000)，與Hcy、CRP水平呈正相關(r=0.724、0.729，均P=0.000)。

表1 兩組MoCA評分比較分)

表2 兩組Hcy、CRP、FA和VitB12水平比較

3 討 論

VCI是老年人常見的進展性認知損害，是由腦血管病或存在的腦血管危險因素引起的一類獲得性認知障礙綜合征，非癡呆型VCI患者的認知損傷是局灶性的癥狀較輕，不易引起警覺，進而發展為癡呆，嚴重危害老年人的身心健康，目前臨床上尚未找到有效的治療手段〔6〕。miRNAs是一類長度20～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA，血漿外泌體中富集大量miRNA，具有較強抗降解能力，miRNA的表達水平也可反映機體的生理和功能狀態，可作為疾病診斷的新型生物學標志〔7〕。血漿外泌體源性miRNA與認知功能障礙有關，研究發現血漿外泌體miR-422a在腦卒中發病早期的患者中表達水平顯著升高；miR-29c表達量與心血管疾病危險因素(糖尿病等)的發生發展也存在密切關系〔8，9〕，但在VCI患者中的應用尚不清楚。

本研究結果說明VCI患者血漿外泌體中miR-29c表達水平升高，提示miR-29c與認知功能障礙相關；VCI降低了患者注意、集中、語言、記憶和空間想象等認知能力，致使認知功能損傷。另外，VCI患者血清中Hcy、CRP水平升高，FA和VitB12水平降低。miR-29c是從神經細胞核糖和核蛋白中發現并克隆出miR-29家族，位于人類的1號染色體上，具有調控人體生物學功能的作用，如細胞增殖、分化和凋亡等〔10〕。劉辰庚等〔11〕發現miR-29c在阿爾茨海默病患者血漿外泌體中表達量顯著降低，可用于阿爾茨海默病早期診斷的候選生物標志物。與本研究結果相符，推測miR-29c可作為VCI疾病治療的作用靶點。Hcy是甲硫氨酸經脫甲基后脫苷得到的一類含硫氨基酸，血清中Hcy高水平會損傷血管內皮細胞，是引發腦血管疾病的危險因素，腦血管病會造成VCI，促進癡呆發展。CRP是炎癥發生時的急性炎性蛋白，血清中CRP水平與腦動脈粥樣硬化密切相關〔12〕。Zhang等〔13〕研究證實血管性癡呆患者血清中Hcy、CRP顯著高于正常人體水平，且與血管性癡呆的嚴重程度呈顯著相關性，是致使VCI的重要危險因子，與本研究結果一致。FA具有保護血管的作用，通過促進合成四氫生物喋呤，加快一氧化氮(NO)的合成和利用，增強血管舒張；VitB12是甲基四氫葉酸轉甲基酶的輔酶，FA和VitB12是Hcy代謝的重要輔助因子〔14〕。此外，本研究結果說明血漿外泌體miR-29c表達量越高，MoCA評分越低，FA、VitB12水平越低，Hcy、CRP水平越高，認知功能損傷越嚴重，提示血漿外泌體miR-29c表達水平與VCI危險因子及腦血管疾病引起的認知功能障礙密切相關。葉蓓等〔15〕發現miR-29c低表達能夠減輕大鼠腦缺血再灌注神經損傷，具有明顯的神經保護功能，miR-29c表達升高，抑制神經細胞遷移，損傷神經功能，造成認知功能障礙。VCI血漿外泌體miR-29c表達升高和血清Hcy、CRP、FA、VitB12水平異常，均會造成認知功能障礙，兩者存在顯著相關性。因此，miR-29c具有作為VCI診斷候選生物標志物的潛能。