胰腺癌組織c-MET表達與循環miR-34a、miR-449水平的相關性

何春華 董來榮 沈亦鈺 王曉光

嘉興醫學院附屬第二醫院普外科，嘉興 314000

微小RNA(microRNA, miRNA)在腫瘤疾病診治中的價值受到越來越多的重視。由于miRNA具有表達時序性和組織特異性，外周血中的含量在疾病發展的某一階段亦相對穩定，因此miRNA是一種頗具潛力的腫瘤標志物[1-2]。間質表皮轉化因子(c-mesenchymal epithelial transition factor, c-MET)是原癌基因MET編碼的蛋白，是胰腺癌重要的預后因子，高水平的c-MET往往提示患者預后不良[3-4]。有研究發現，c-MET存在miR-34a和miR-449結合位點，且這兩個miRNA都是公認的抑癌基因[5]。本研究旨在探討胰腺癌組織c-MET的表達與循環miR-34a和miR-449水平的相關性，為胰腺癌的診治靶點提供理論依據。

資料與方法

一、一般資料

收集2015年3月至2017年3月間嘉興醫學院附屬第二醫院普外科行手術治療的41例胰腺癌患者的臨床資料，其中男性23例，女性18例；年齡43～75歲，中位年齡63歲，平均年齡64歲。納入標準：(1)手術病理證實為胰腺導管腺癌；(2)保存手術切除的胰腺癌組織及其匹配的經病理證實的癌旁正常胰腺組織；(3)保存手術前和手術后3個月首次復查的肝素抗凝的全血樣本；(4)臨床資料和隨訪資料完整。排除標準：(1)手術前有放化療和免疫靶向治療等其他療法干預史；(2)術后隨訪時間不足2年；(3)隨訪期內發生其他惡性腫瘤者；(4)合并糖尿病或傳染病者。記錄患者的年齡、性別、體重指數(body mass index, BMI)及腫瘤部位、大小、分化程度、臨床分期、淋巴結轉移、遠處轉移情況等。所有患者完成>2年的隨訪，統計病死率。

二、胰腺癌組織c-MET表達檢測

取甲醛固定的胰腺癌及癌旁正常胰腺組織，常規石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色，由病理科醫師閱片。另取石蠟切片，采用免疫組織化學法檢測組織c-MET表達。兔抗人c-MET一抗(ab252205，Abcam)工作濃度1∶50，山羊抗兔二抗(ab205718，Abcam)工作濃度1∶2 000，最后DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，中性樹膠封固。由病理科醫師閱片，胞質或胞膜出現棕黃色顆粒為c-MET陽性，依據陽性細胞所占比例(1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分)及染色強度(無染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，深黃色為3分，黃褐色為4分)進行評分，兩分相加≥4分為c-MET陽性。

三、循環miR-34a、miR-449提取及檢測

取術前未經抗腫瘤治療及術后3個月首次復查時的空腹肘靜脈血，加入肝素抗凝的試管，混均后置-80℃無菌存儲。應用miRNA快速提取試劑盒提取和純化循環miRs，采用熒光定量PCR法測定循環miR-34a、miR-449水平。先逆轉錄生成 cDNA，再應用熒光定量PCR擴增試劑盒擴增生成miR-34a或miR-449，嚴格按照試劑盒說明書操作。 miR-34a、miR-449及內參U6引物序列見表1，引物由上海生工生物技術工程股份有限公司設計并合成。PCR反應程序：95℃ 60 s，95℃ 30 s、60℃ 30 s、2℃ 30 s，40個循環。由儀器自帶軟件獲取Ct值，根據公式2-△△Ct計算miR的表達量。

四、統計學處理

表1 靶向 miR-34a、miR-449、U6的引物序列

結 果

一、胰腺癌組織c-MET表達及其與患者臨床病理參數的關系

胰腺癌組織c-MET陽性表達率為63.4%(26/41)，癌旁正常胰腺組織的c-MET陽性表達率為24.4%(10/41)，胰腺癌組織明顯高于癌旁正常胰腺組織，差異有統計學意義(χ2=12.676，P=0.000)。胰腺癌組織c-MET陽性表達與患者年齡、性別、BMI及腫瘤部位、分化程度均無相關性，但與TNM分期及淋巴結轉移相關，即c-MET陽性患者TNM Ⅲ/Ⅳ期、淋巴結轉移率均明顯高于c-MET陰性患者，差異均有統計學意義(表2)。

二、胰腺癌組織c-MET表達與患者預后的關系

c-MET陽性與c-MET陰性患者的生存率分別為38.5%和53.3%，中位生存期分別為29.5個月和35.0個月；無進展生存率分別為19.2%和40.0%，無進展中位生存期分別為24個月和33個月。c-MET陽性患者的生存率及無進展累積生存率均較c-MET陰性患者明顯縮短，病死率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。

三、胰腺癌組織c-MET表達與循環miR-34a、miR-449水平的關系

術前c-MET陽性患者循環miR-34a與miR-449水平較c-MET陰性患者低，差異有統計學意義；術后兩組患者循環miR-34a水平的差異無統計學意義，但c-MET陽性患者miR-449水平低于c-MET陰性患者，差異有統計學意義(表3)。

四、術前循環miR-34a、miR-449水平對胰腺癌TNM分期、淋巴結轉移和預后的預測價值

術前循環miR-34a、miR-449水平對胰腺癌淋巴結轉移、TNM Ⅲ/Ⅳ期及預后均有較好的預測價值(圖2，表4)。

表2 胰腺癌組織c-MET表達與患者臨床病理參數的關系

注：c-MET為間質表皮轉化因子；BMI為體重指數

注：c-MET為間質表皮轉化因子

圖1c-MET陽性與陰性的胰腺癌患者生存曲線(1A)和無進展生存曲線(1B)

表3 胰腺癌組織c-MET陽性與陰性患者手術前后循環miR-34a、miR-449水平的比較

注：c-MET為間質表皮轉化因子

圖2 循環miR-34a、miR-449水平預測腫瘤Ⅲ/Ⅳ期(2A)、淋巴結轉移(2B)及隨訪期患者死亡(2C)的ROC曲線

表4 循環miR-34a、miR-449水平預測胰腺癌病情和預后的ROC曲線分析

討 論

miRNA不具有蛋白翻譯功能，主要依靠錨定mRNA來發揮生物學活性，與抑癌基因結合可發揮促癌作用，與原癌基因結合可發揮抑癌作用。Li等[6]報道，miR-155-5p靶向結合腫瘤蛋白p53誘導核蛋白1抑制宮頸癌細胞轉移。Yan等[7]報道，miR-629靶向結合FOXO3促進胰腺癌進展。張宏偉和王彩茹[8]報道，miR-222靶向調控PTEN表達抑制胰腺癌細胞的侵襲遷移能力。吳翔等[9]報道，胰腺導管腺癌miR-21與TGF-β1信號通路相關。

文獻報道，RNA結合蛋白STAT3能促進肺癌細胞生成miR-34a，使細胞周期停滯在G期[10]；miR-34a可調控酪氨酸激酶受體2，抑制癌細胞的耐藥[11]；SNHG7通過調節miR-34a-Snail-EMT信號通路，進而抑制胃癌細胞的遷移與侵襲能力[12]；miR-449a靶向調節c-MET抑制Hela細胞的遷移及侵襲能力[13]。這些研究結果支持miR-34a、miR-449具有抑癌作用。

c-MET能夠特異性與肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)結合，參與多種腫瘤性疾病的發生與發展[14-15]。王玲[16]從多個數據庫(Oncomine、cBioportal、GEPIA等)收集胰腺癌c-MET表達的有關論文，證實c-MET在胰腺癌組織顯著高表達。c-MET抑制劑用于抑制胰腺癌細胞增殖的基礎研究也已取得了一定的進展[17]，表明c-MET是一種原癌基因，促進腫瘤的發生與發展。

本研究結果顯示，胰腺癌組織c-MET蛋白表達明顯高于癌旁正常胰腺組織，c-MET陽性患者的TNM分期以Ⅲ/Ⅳ期居多，淋巴結轉移率更高，生存時間更短，病死率更高，與文獻報道基本一致[18]。進一步分析發現，治療前c-MET陽性患者的循環miR-34a、miR-449水平明顯低于c-MET陰性患者，手術后循環miR-34a、miR-449水平均明顯回升，術前循環miR-34a、miR-449水平對胰腺癌淋巴結轉移、TNM Ⅲ/Ⅳ期及預后有較好的預測價值，均提示c-MET與miR-34a、miR-449之間存在負反饋調節作用。c-MET可作為潛在的腫瘤標志物展開深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突