SLAMF7在大顆粒淋巴細胞白血病患者外周血淋巴細胞中的表達及意義

康萍，蔣茜，毛朝明，劉佳夢，丁超，董利陽

江蘇大學附屬醫院，江蘇鎮江212001

大顆粒性淋巴細胞白血病(LGLL)是一種罕見的慢性成熟淋巴細胞增殖性疾病，其特征是原因不明的CD3+T/CD3-NK細胞的單克隆增殖[1]。大顆粒淋巴細胞的形態特征為胞體變大，細胞核腎型或者半圓型，胞質增多，內含有豐富的嗜天青顆粒[2]。通常，形態學上難以區分病理性單克隆增殖的大顆粒淋巴細胞和生理反應性多克隆增殖的大顆粒淋巴細胞[3，4]。LGLL的臨床診斷復雜且費時，沒有標準、有效的治療方案，因此需要尋找新的免疫標志物協助快速診斷及治療。信號淋巴細胞活化分子家族7(SLAMF7)是一種糖基化的細胞表面蛋白，是信號淋巴細胞活化分子(SLAM)家族的成員[5]。SLAMF7除了在正常的NK細胞、部分T細胞亞群、活化的B細胞、漿細胞表達外，還表達在一些造血系統腫瘤細胞中[6]。越來越多的研究表明，SLAMF7在多種疾病中發揮重要作用，抗SLAMF7的單克隆抗體埃羅妥珠單抗(Elotuzumab)已成功用于多發性骨髓瘤的臨床治療[7]，而關于SLAMF7和LGLL的研究較少。2015年3月～2019年8月，本研究觀察了LGLL患者外周血淋巴細胞中SLAMF7的表達，及其與嗜天青大顆粒主要成分顆粒酶B(Granzyme B)和穿孔素(Perforin)表達水平的相關性，為尋找LGLL新的診斷指標及治療靶點提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月～2019年8月就診于江蘇大學附屬醫院的LGLL患者9例(病例組)進入研究，男7例、女2例，年齡52～69歲，T大顆粒淋巴細胞白血病(T-LGLL)6例、NK大顆粒淋巴細胞白血病(NK-LGLL)3例。患者均符合LGLL的診斷標準[8]，至少滿足以下3個條件：①血液中存在大顆粒淋巴細胞(>500/μL)長于6個月，或大顆粒淋巴細胞數目較低但為單克隆性，且患者表現出其他典型的臨床或血液學特征，如類風濕關節炎或細胞減少癥；②具有典型的免疫表型，如T-LGLL典型免疫表型為CD3+CD8+CD57+，NK-LGLL為CD3-CD8+CD16+CD56+；③PCR或流式細胞術分析T細胞受體(TCR)基因重排確認T細胞克隆性，殺傷性免疫球蛋白樣受體(KILR)激活亞型限制性表達表示NK細胞單克隆擴增[9，10]。同時招募15例年齡、性別相匹配且無造血系統疾病、無自身免疫性疾病和活動性感染的健康志愿者作為對照組。本研究獲得江蘇大學附屬醫院倫理委員會的批準，患者均對研究方案知情同意。

1.2 病例組和對照組外周血淋巴細胞中SLAMF7檢測 取兩組EDTA-K2抗凝的外周全血100 μL，用PerCp Cy5.5偶聯抗人CD3抗體、FITC偶聯CD8抗體、PE偶聯SLAMF7抗體、BV510偶聯抗人CD45抗體、BV421偶聯抗CD56抗體及Alexa Fluor 647偶聯抗人SLAMF7抗體、APC efluor 780偶聯FVD抗體染色(用于標記死亡細胞)，加入1 mL稀釋后的紅細胞裂解液靜置10 min，離心去上清以去除紅細胞后，用PBS洗滌2次，用400 μL的PBS重懸，上FACS Caliber流式細胞儀檢測。以CD45/SSC-A設門篩選出活淋巴細胞，進一步篩選細胞毒性T細胞(CD3+CD8+)和NK細胞(CD3-CD56+)后，分析SLAMF7陽性細胞。采用FlowJo10.1軟件進行數據分析。每組樣本重復檢測3次，取均值。

1.3 病例組與對照組淋巴細胞形態觀察 取兩組EDTA-K2抗凝的外周血以制作頭、體、尾分明的血涂片若干張，自然干燥后，滴加5滴瑞氏-吉姆薩染液1 min后滴加10滴pH 6.4的PBS輕輕晃動載玻片，室溫靜置15 min，流水沖去多余染液，干燥后于顯微鏡下觀察淋巴細胞形態。

1.4 病例組大顆粒淋巴細胞Granzyme B、Perforin檢測 取病例組EDTA-K2抗凝的外周血100 μL，以“1.2”步驟進行表面抗體染色后，按照說明書進行細胞內Granzyme B、Perforin染色，流式細胞儀檢測Granzyme B、Perforin陽性細胞，每組樣本重復檢測3次，取均值。

1.5 慢性活化淋巴細胞模型制作及SLAMF7表達觀察 取對照組EDTA-K2抗凝的外周血10 mL，利用Ficoll密度梯度離心法從人淋巴細胞分離液提取外周血單個核細胞(PBMC)，用含10%胎牛血清的1640培養基將PBMC濃度調整為1×106/mL。根據預實驗結果，選擇0.5 μg/mL的植物血凝素(PHA)制作慢性活化淋巴細胞模型。將1×106個PBMC接種于24孔板，加入含0.5 μg/mL PHA、100 U/mL IL-2的無血清培養基750 μL，分別于培養0、24、48、72 h收集細胞，參照“1.2”方法，采用流式細胞術檢測CD4+T細胞、CD8+T細胞中SLAMF7表達及CD4/CD8比例，FlowJo10.1軟件分析結果。每組樣本重復檢測3次。

2 結果

2.1 兩組外周血淋巴細胞中SLAMF7表達比較 病例組T-LGLL患者、對照組CD8+T細胞中SLAMF7陽性表達率分別為99.55%±0.16%、65.75%±9.00%，病例組T-LGLL患者CD8+T細胞中SLAMF7陽性表達率高于對照組(P<0.05)；病例組NK-LGLL患者、對照組NK細胞中SLAMF7陽性表達率分別為98.63%±0.32%、99.13%±0.59%，兩組相比，P>0.05。

2.2 兩組淋巴細胞形態特點及SLAMF7與嗜天青顆粒表達的關系 與正常淋巴細胞相比，大顆粒淋巴細胞體積變大、胞質增多、細胞核大且不規則，其中可見多少不等的核仁，輕微嗜堿性胞質中出現大小不等的嗜天青大顆粒(圖1)。大顆粒淋巴細胞中SLAMF7陽性表達率為98.60%±0.50%、Granzyme B+Perforin陽性表達率為90.92%±0.90%，Pearson相關分析顯示，SLAMF7陽性表達與Granzyme B+Perforin陽性表達呈正相關(r=0.818，P<0.05)。

圖1 病例組大顆粒淋巴細胞形態(瑞氏-吉姆薩染色)

2.3 PHA刺激后CD4+T細胞、CD8+T細胞中SLAMF7表達及CD4/CD8比例變化 0.5 μg/mL的PHA刺激3 d后，CD4/CD8比例無明顯變化，0、24、48、72 h分別為1.356±0.01、1.407±0.03、1.290±0.02、1.270±0.02(P均>0.05)。0.5 μg/mL的PHA刺激0、24、48、72 h后CD4+T細胞中SLAMF7陽性表達率分別為29.40%±1.20%、52.70%±3.90%、79.40%±0.20%、51.80%±3.50%，CD8+T細胞中SLAMF7陽性表達率分別為49.93%±2.59%、72.47%±2.28%、98.73%±0.64%、99.17%±0.43%。CD4+T細胞中SLAMF7陽性表達率在PHA刺激24 h后上調，48 h時達峰值，72 h時有所降低(P均<0.05)；CD8+T細胞中SLAMF7陽性表達率從刺激24 h后逐漸升高，48 h達峰值，72 h仍維持高值(P均<0.05)；低濃度PHA持續刺激3 d后，CD8+T細胞中SLAMF7陽性表達率高于CD4+T細胞(P均<0.05)。

3 討論

2002年WHO將LGLL分為T-LGLL和NK-LGLL，2008年又根據臨床表現將后者分為侵襲性大顆粒淋巴細胞白血病(ANKL)和慢性NK細胞淋巴增殖性疾病(CLPD-NK)，并沿用至今[11,12]。T-LGLL作為最常見的LGLL(>75%)，臨床表現多為無癥狀或進展緩慢，中位生存期可達10年，但近年來不斷有侵襲性T-LGLL的病例報道，多與NK細胞相關抗原的表達有關(如CD56)。NK-LGLL相對罕見(<15%)，CLPD-NK(<10%)臨床表現與T-LGLL相似，二者治療方案多采取隨訪觀察，必要時予以對癥治療[13，14]。在實際臨床工作中，從形態學上難以區分病理性的單克隆大顆粒淋巴細胞和生理反應性的多克隆大顆粒淋巴細胞。LGLL的診斷需結合臨床表現、細胞形態學、免疫表型、分子遺傳學指標，診斷過程復雜且費時，治療方案多參考少量的回顧性分析。因此，需要尋找新的免疫標志物以協助該病的快速診斷及治療。

SLAMF7是免疫球蛋白超家族受體CD2家族的一員，能夠活化其胞內基于免疫受體酪氨酸的開關基序(ITSMs)，招募EAT-2調節淋巴細胞的免疫功能[6]。對SLAMF7的研究主要集中在多發性骨髓瘤(MM)的治療方面，人源化的抗SLAMF7單克隆抗體Elotuzumab可通過直接激活NK細胞、增強抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)、阻斷可溶性SLAMF7(sSLAMF7)與MM細胞上SLAMF7間的相互作用這三種途徑清除腫瘤細胞[15，16]。但目前尚無關于SLAMF7和LGLL的研究。本研究發現,SLAMF7在T-LGLL患者的CD3+CD8+大顆粒T細胞中明顯高表達；雖然在NK-LGLL大顆粒淋巴細胞中SLAMF7也呈強表達，但與正常NK細胞表達差異無統計學意義。大顆粒淋巴細胞的特征是胞質中出現多少不等的嗜天青顆粒，其中最主要的成分包括Perforin和Granzyme B，而Perforin和Granzyme B主要存在于細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞中，是宿主細胞殺傷靶細胞的主要效應分子[17]。在NK細胞中，SLAMF7活化后，通過一系列途徑導致Ca2+內流增強、MAPK/ERK通路激活，最終導致NK細胞中顆粒極化、促進細胞毒顆粒向靶細胞釋放[18]，因此，推測SLAMF7可能參與大顆粒淋巴細胞中嗜天青顆粒的形成。我們對患者的血涂片進行瑞氏-吉姆薩染色，鏡檢顯示腫瘤細胞為胞質中顆粒增多的大淋巴細胞；相關性分析表明，大顆粒淋巴細胞中SLAMF7陽性表達與Perforin+Granzyme B陽性表達呈正相關，間接表明SLAMF7與白血病細胞中的大顆粒有關。有學者發現，系統性紅斑狼瘡患者外周血中Perforin+Granzyme B的表達僅限于SLAMF7+CD8+T細胞，且SLAMF7活化能夠增強CD8+T細胞的活性[19]，這進一步支持了我們的推測。

至今，LGLL的發病原因仍不清楚，但多數學者認為是由未知抗原(細菌、病毒等)的慢性持續刺激導致淋巴細胞的異常活化與單克隆增殖[14]。我們利用低濃度的PHA持續刺激PBMC來模擬淋巴細胞慢性活化，并觀察SLAMF7表達的變化。實驗結果顯示，在相同刺激條件下，CD8+T細胞中SLAMF7陽性表達增加明顯高于CD4+T細胞，且更穩定，這與我們在T-LGLL患者中觀察到的SLAMF7在CD8+T細胞中高表達的現象相一致，由此推斷SLAMF7可作為CD8+T細胞持續活化的指標。

綜上，本研究發現，SLAMF7在LGLL大顆粒淋巴細胞中高表達，并與細胞中嗜天青大顆粒主要成分Perforin和Granzyme B的表達水平呈正相關，提示SLAMF7是細胞毒性淋巴細胞的特征標志，有望成為LGLL潛在的診斷指標及治療靶點。由于LGLL發病率低，本研究樣本量不足，在接下來的研究中，我們將擴大樣本量進一步探討SLAMF7在LGLL發生、發展中的作用。有研究表明SLAMF7能夠誘導同樣缺乏EAT-2的MM細胞的中樞生長和生存信號通路[20]，推測SLAMF7本身參與了LGLL白血病性細胞的顆粒形成、凋亡或腫瘤細胞間同型黏附激活的生存通路的調節。本研究結果為LGLL新的診斷標志物或免疫治療靶點的探索提供了理論依據。