子癇前期患者血清miR-195及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平觀察

牛三強(qiáng)，于康軍，譚憲巖，陳玲，陳東穎

1亳州市人民醫(yī)院，安徽亳州236800；2安徽省立醫(yī)院

子癇前期是一種常見且嚴(yán)重的妊娠并發(fā)癥[1]，是全世界孕產(chǎn)婦和嬰兒死亡的主要原因之一[2]。子癇前期發(fā)病機(jī)制尚不明確，癥狀表現(xiàn)為高血壓、顯著的蛋白尿、血管內(nèi)皮功能障礙和全身炎癥反應(yīng)，需要一些可靠標(biāo)志物以幫助早期診斷。多項(xiàng)研究表明，先兆子癇的發(fā)病與相關(guān)基因甲基化狀態(tài)密切相關(guān)[3，4]。DNA甲基化通常是在胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)的背景下以共價(jià)鍵添加一個(gè)甲基到胞嘧啶[5]。先前的研究表明，表觀遺傳修飾(包括甲基化)可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-195表達(dá)異常參與了子癇的發(fā)生[7]，但關(guān)于miR-195啟動(dòng)子區(qū)甲基化在子癇前期發(fā)病中作用的研究較少。因此，本研究觀察了子癇前期患者血清miR-195及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平變化，并分析其與子癇前期臨床特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年8月～2018年8月在亳州市人民醫(yī)院就診的孕婦參與研究。子癇前期孕婦30例為病例組，年齡23～42(29.7±3.5)歲，孕次(1.7±0.6)次，BMI (27.5±2.2)kg/m2，排除有其他并發(fā)癥者。健康無(wú)合并癥孕婦30例為對(duì)照組，年齡24～41(30.8±2.3)歲，孕次(1.5±0.7)次，BMI (25.5±5.2)kg/m2。兩組一般資料差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)亳州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并經(jīng)患者知情同意。

1.2 血清miR-195檢測(cè) 采用qRT-PCR法。收集患者外周血2～3 mL，分離血清，-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肨RIzol試劑盒(北京天根生物有限公司)提取細(xì)胞總RNA，miR-195和內(nèi)參U6引物以及探針由上海閃晶分子生物有限公司設(shè)計(jì)合成，使用FTC-3000P PCR儀器(加拿大楓嶺生物公司)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。miR-195上游引物序列為5′-AGCTTCCCTGGCTCTAGCA-3′，下游引物序列為5′-CTGGAGCAGCACAGCCAATA-3′；U6上游引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATA-3′，下游引物序列為5′-CTTCACGAATTTGCGTG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、50個(gè)PCR循環(huán)。以2-ΔΔCt表示miR-195相對(duì)表達(dá)量。

1.3 miR-195啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)

1.3.1 miR-195啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性PCR(MSP)引物設(shè)計(jì) 通過(guò)UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得miR-195啟動(dòng)子區(qū)及其上下游各1 000 bp序列，使用Methprimer預(yù)測(cè)軟件設(shè)計(jì)miR-195啟動(dòng)子區(qū)MSP引物，miR-195甲基化特異性引物(M)上游序列為5′-GGTTTGTAAAAATTTTCGGTATAAAC-3′，下游引物序列為5′-GACATATTTAATATCACACGACGAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物157 bp，退火溫度57 ℃；miR-195非甲基化特異性引物(U)上游序列為5′-TTGTAAAAATTTTTGGTATAAATGG-3′，下游引物序列為5′-CAACATATTTAATATCACACAACAAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物155 bp，退火溫度56 ℃。

1.3.2 MSP反應(yīng) PCR反應(yīng)體系為20 L，模板為經(jīng)去甲基化試劑盒處理的孕婦外周血DNA 2 L，10×PCR buffer 2 L，Mg2+1.6 μL，dNTP mix 0.4 L，DMSO 4 L，上下游引物10 pmol/L各2 L，HSTaq酶 0.2 L，滅菌水11.4 L。取5 L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2.0%瓊脂糖凝膠電泳25 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，根據(jù)DNA條帶判斷結(jié)果：甲基化陽(yáng)性為M引物擴(kuò)增出目的條帶、U引物未擴(kuò)增出目的條帶，M引物和U引物均擴(kuò)增出目的條帶；甲基化陰性為U引物擴(kuò)增出目的條帶而M引物未擴(kuò)增出目的條帶。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-195水平比較 病例組、對(duì)照組血清miR-195水平分別為0.558±0.153、0.955±0.213，病例組血清miR-195水平低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.2 兩組miR-195啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平比較 病例組、對(duì)照組miR-195啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率分別為62%(23/30)、24%(11/30)，病例組miR-195啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 miR-195表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化與子癇前期臨床病理參數(shù)的關(guān)系 臍動(dòng)脈S/D≥2.6的子癇前期患者血清miR-195水平高于S/D<2.6者，miR-195啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率低于S/D<2.6者(P均<0.05)。血清miR-195及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與患者年齡、孕周、BMI及尿蛋白水平無(wú)關(guān)。見表1。

表1 血清miR-195及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化與子癇前期臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：#Fisher′s檢驗(yàn)結(jié)果。

3 討論

miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)影響幾乎所有細(xì)胞功能[8]。miRNA是長(zhǎng)度為18～22個(gè)核苷酸的小非編碼RNA，其通過(guò)抑制核糖體上的基因翻譯過(guò)程或通過(guò)降解相應(yīng)的mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平上起作用[9，10]。目前已經(jīng)鑒定了超過(guò)1 500種人類miRNA，約50%的蛋白質(zhì)編碼基因都受其調(diào)節(jié)[9～11]。子癇前期的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未完全了解。對(duì)于miRNA在子癇前期發(fā)病過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制也不完全清楚。目前已知缺氧可能是影響胎盤活動(dòng)過(guò)程的主要因素。一系列miRNA(miR-205、335、224、451、491、210)在低氧水平下表達(dá)上調(diào)，而miR-424表達(dá)減少[12]。miRNA在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)節(jié)，但表觀遺傳機(jī)制也可以影響miRNA的表達(dá)[13]。

滋養(yǎng)細(xì)胞分化與DNA甲基化及非甲基化狀態(tài)有關(guān)。滋養(yǎng)細(xì)胞分化過(guò)程中，一些基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化及非甲基化狀態(tài)可以改變基因表達(dá)狀態(tài)，繼而影響滋養(yǎng)細(xì)胞生理功能，參與子癇前期的發(fā)病[14]。胎盤形成的機(jī)制是滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)蛻膜和子宮肌層的遷移和侵襲[15]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在重度子癇前期狀態(tài)下，miR-675表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)過(guò)多滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖[16]。還有研究表明，miR-195、miR-376c和miR-378a-5p通過(guò)抑制Nodal/TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲，三者在子癇前期患者中表達(dá)下調(diào)[7，17，18]。血液循環(huán)中miRNA的特異性等特點(diǎn)使其具備了作為疾病早期診斷分子標(biāo)志物的可能[19]。已有研究開始利用外周血miRNA定量檢測(cè)來(lái)評(píng)估及預(yù)測(cè)子癇前期等疾病。本研究采用qRT-PCR法檢測(cè)了子癇前期患者血清中的miR-195，結(jié)果顯示，病例組血清miR-195水平低于對(duì)照組，提示miR-195表達(dá)變化可能參與了子癇前期的發(fā)病，具體機(jī)制目前尚未明確。

馬穎等[20]研究顯示，子癇前期與鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(GNA12)啟動(dòng)子甲基化水平降低相關(guān)，外周血基因甲基化檢測(cè)對(duì)子癇前期的早期診斷也有一定意義。本研究通過(guò)MSP檢測(cè)子癇前期患者和對(duì)照組血清miR-195啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，結(jié)果表明，病例組血清miR-195啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平高于對(duì)照組，且子癇前期孕婦miR-195啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與孕婦年齡、分娩時(shí)間、BMI及尿蛋白量無(wú)關(guān)，而與臍動(dòng)脈S/D有關(guān)，可能是miR-195啟動(dòng)子區(qū)高甲基化抑制了miR-195表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)其下游的與子癇前期相關(guān)的靶基因過(guò)表達(dá)，影響相關(guān)通路的調(diào)節(jié)功能，導(dǎo)致子癇前期的發(fā)病。已有研究表明，miR-195通過(guò)干擾其靶基因ActRIIA表達(dá)，影響Activin/Nodal信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生[16]。因此，我們推測(cè)miR-195在子癇前期中低表達(dá)可能主要與其啟動(dòng)子區(qū)高甲基化有關(guān)，其甲基化水平變化可能參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展。

總之，本研究結(jié)果顯示，子癇前期患者血清miR-195水平降低，啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平升高，推測(cè)miR-195表達(dá)變化可能參與了子癇前期的發(fā)病，具體機(jī)制將在后續(xù)研究中進(jìn)一步闡明。