TRIM59在人肝癌細胞中表達變化及其對細胞增殖、P53蛋白表達的影響

盧光輝，孫綱，劉子源，徐鵬，邵潤東，陳琦，鮑豐羽

1錦州醫科大學中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六七醫院研究生培養基地，遼寧大連116021；2中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六七醫院

人肝細胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，發病率逐年增加[1，2]。我國每年約36.9萬人死于肝癌，約占全球肝癌死亡病例總數的47.2%。由于缺乏早期敏感的診斷標志物及方法，HCC通常于晚期確診，預后不良，患者5年生存率低于7%[4]。因此，如何更好地明確HCC發生的分子機制、尋找早期診斷方法、改進治療方案是相關研究的重點。三結構域蛋白59(TRIM59)是一種存在于不同腫瘤細胞中的新型生物標志物[5～8]，其具有高度結構穩定性及廣泛的生物學活性。TRIM59被認為是一種癌基因，TRIM59的過表達可能參與細胞中一些致癌基因的突變，導致惡性腫瘤發生、發展[9]。關于TRIM59在HCC細胞中的作用及功能，目前國內外文獻報道尚少。2018年12月～2019年2月，本研究觀察了TRIM59在不同HCC細胞中的表達變化，及其對細胞增殖、p53蛋白表達的影響，探討可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 6種HCC細胞系(Huh7、Hep3B、HepG2、SK-Hep1、BEL7402、SMMC7721)及人正常肝細胞系LO2均購自ATCC公司。細胞培養基RPMI-1640、EMEM、DMEM、10%胎牛血清購自GIBCO公司。1%青霉素-鏈霉素購自Beyotime公司。小鼠E17 cDNA文庫來自Clontech實驗室。脂質體3000購自Invitrogen公司。抗TRIM59及TRIM59的慢病毒顆粒購自Santa Cruz公司。pcDNA3.1-TRIM59質粒和pcDNA3.1-Vector對照質粒購自Gene Copoeia公司。普羅霉素購自Sigma公司。抗p53和GAPDH購自Cell Signaling Technology公司。RNeaseMini試劑盒購自QIAGEN公司。SsoFastEvaGreen超級混合物、增強化學發光系統購自Bio-Rad公司。裂解緩沖液購自Roche公司。

1.2 HCC細胞與正常肝細胞中TRIM59 mRNA及蛋白檢測 用RNeaseMini試劑盒從細胞中提取總RNA。采用qRT-PCR法檢測TRIM59 mRNA。PCR反應體積10 μL，包括SsoFast EvaGreen超級混合物5 μL、cDNA模板1 μL、兩對引物各1 μL。TRIM59 mRNA上游引物序列為5′-TACGAGAGCAGCTGGAA-3′，下游引物序列為5′-ACGGGTTGAACCTCAGGAAG-3′。PCR反應條件為95 ℃ 1 min、95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共30個循環。實驗重復3次。目標基因的表達針對內參基因house keeping水平進行標準化，表示TRIM59 mRNA相對表達量，實驗重復3次。采用Western blotting法檢測HCC細胞系及正常肝細胞中的TRIM59蛋白，以GAPDH為內參。實驗重復進行3次，使用Image J軟件進行圖像處理，分析灰度值。

1.3 TRIM59對HCC細胞增殖及p53蛋白表達影響觀察

1.3.1 細胞分組與轉染 選擇預實驗中TRIM59 mRNA和蛋白表達水平相對較高的HepG2、Huh7細胞系進行實驗。將HepG2細胞分為shTRIM59組和shControl組，shTRIM59組感染TRIM59慢病毒，shControl組感染TRIM59慢病毒陰性對照。將Huh7細胞分為pcDNA3.1-TRIM59組和pcDNA3.1-Vector組；采用PCR法從小鼠E17 cDNA文庫中擴增TRIM59，將含有TRIM59 cDNA的片段亞克隆到pcDNA3.1質粒上；用脂質體3000將pcDNA3.1-TRIM59質粒和陰性對照分別導入至pcDNA3.1-TRIM59組和pcDNA3.1-Vector組Huh7細胞。感染或轉染后繼續培養48 h。提取各實驗組總RNA和蛋白。采用Western blotting法檢測TRIM59蛋白。shTRIM59組、shControl組的HepG2細胞中TRIM59蛋白相對表達量分別為0.46±0.06、1.03±0.02(P<0.05)。pcDNA3.1-TRIM59組、pcDNA3.1-Vector組的Huh7細胞中TRIM59蛋白相對表達量分別為0.60±0.01、0.13±0.01(P<0.05)。表明兩種細胞均感染或轉染成功。

1.3.2 細胞增殖能力檢測 取感染或轉染后的兩種HCC細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，按1×103/孔平鋪于6孔板內，于37 ℃、5%CO2條件下在完全培養基中培養。每3 d更換1次培養基，約14 d后形成肉眼可見的細胞集落(每個集落≥50個細胞)。用0.1%結晶紫染色，光學顯微鏡下計算集落形成數，表示細胞增殖能力。實驗重復進行3次，使用Image J軟件進行圖像處理。

1.3.3 p53蛋白檢測 當兩種HCC細胞融合率達到90%時，提取總蛋白，并用Bradford法進行鑒定。用聚丙烯酰胺電泳分離蛋白，轉膜之后，將硝酸纖維素濾膜(NC)與一抗共同孵育，4 ℃過夜，TBST洗膜3次。加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。ECL發光液顯影，以GAPDH為內參。實驗重復進行3次，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1 HCC細胞、正常肝細胞中TRIM59 mRNA及蛋白表達比較 BEL7402、Hep3B、HepG2、Huh7、SMMC7721、SK-Hep1、LO2細胞中TRIM59 mRNA相對表達量分別為10.86±0.97、8.74±0.23、62.41±7.53、63.99±5.91、30.51±3.21、9.99±0.20、0.03±0.01，TRIM59蛋白相對表達量分別為0.14±0.01、0.13±0.02、0.68±0.04、0.72±0.03、0.33±0.02、0.12±0.02、0.00±0.01，各HCC細胞中TRIM59 mRNA及蛋白相對表達量均高于LO2細胞(P均<0.05)。在6種HCC細胞系中，HepG2細胞TRIM59 mRNA及蛋白相對表達量均高于BEL7402、Hep3B、SMMC7721、SK-Hep1細胞(P均<0.05)；Huh7細胞TRIM59 mRNA及蛋白相對表達量均高于BEL7402、Hep3B、SMMC7721、SK-Hep1細胞(P均<0.05)。選取HepG2細胞及Huh7細胞為下一階段的實驗細胞。

2.2 TRIM59對HepG2、Huh7細胞增殖能力的影響 shControl組、shTRIM59組HepG2細胞集落形成數分別為(137.00±2.65)、(57.67±2.01)個，shTRIM59組集落形成數低于shControl組(P<0.05)。pcDNA3.1-Vector組、pcDNA3.1-TRIM59組Huh7細胞集落形成數分別為(87.67±2.52)、(150.33±1.15)個，pcDNA3.1-TRIM59組集落形成數高于pcDNA3.1-Vector組(P均<0.05)。見圖1。

2.3 TRIM59對HepG2、Huh7細胞中p53蛋白表達的影響 shControl組、shTRIM59組HepG2細胞中p53蛋白相對表達量分別為0.71±0.05、1.32±0.06，shTRIM59組p53蛋白相對表達量高于shControl組(P<0.05)。pcDNA3.1-Vector組、pcDNA3.1-TRIM59組Huh7細胞中p53蛋白相對表達量分別為0.93±0.02、0.77±0.03，pcDNA3.1-TRIM59組p53蛋白相對表達量低于pcDNA3.1-Vector組(P<0.05)。

3 討論

注：A為shControl組；B為shTRIM59組；C為pcDNA3.1-Vector組；D為pcDNA3.1-TRIM59組。

圖1 TRIM59表達對HepG2、Huh7細胞增殖能力的影響

HCC在肝臟疾病中占有相當一部分比例[10]。HCC早期無典型臨床表現，惡性度高、轉移率高、復發率高，多數患者一經確診就已發展為進展性，錯過了最佳治療時期。加之部分腫瘤細胞先天或后天的耐藥性，多數患者經規范化手術治療聯合術后化療后預后仍不樂觀[11，12]。從分子生物學層面解讀HCC的發病機制，尋找更有效的治療方法尤為重要。作為一種新發現的癌基因，TRIM59有著典型的RBCC結構域，即從N端到C端依次為鋅指結構域(RING finger)、B-BOX結構域、卷曲螺旋(Coiledcoil)結構域[13]，被證明存在于不同的腫瘤細胞中，并參與腫瘤細胞增殖、轉移和侵襲的調控[14～16]。但是，TRIM59在HCC中的表達情況及具體作用機制少見報道。

本研究結果顯示，與正常肝細胞相比，HCC細胞中TRIM59 mRNA高表達。上調HepG2細胞中TRIM59表達后，HCC細胞的增殖能力明顯增強；降低Huh7細胞中TRIM59表達后，細胞增殖能力明顯減弱。由此可見，TRIM59高表達有利于HCC細胞的增殖。

為進一步探究TRIM59對HCC細胞的作用機制，我們查閱相關文獻發現，TRIM59在胃癌細胞中可促進p53的泛素化和降解[17]，從而使p53失去了對細胞增殖的抑制而導致胃癌；TRIM59可通過對p53的泛素化和降解而導致一些腫瘤細胞的增殖和侵襲[18，19]。而在HCC細胞中，TRIM59能否對p53的表達產生影響仍不明確。本研究通過調節TRIM59在HCC細胞中的表達，探討TRIM59的作用及與p53的關系。研究結果顯示，上調Huh7細胞中TRIM59表達后，p53表達水平明顯下調；而下調HepG2細胞中TRIM59表達后，p53表達水平顯著上調。這表明干預HCC細胞中TRIM59的表達后，p53的表達可相應發生改變，提示TRIM59可能通過調節p53信號通路進而對HCC細胞產生影響。

p53作為一種廣泛存在于機體細胞中的抑癌基因，可通過對細胞周期進程的阻斷和促使細胞凋亡來有效抑制腫瘤細胞的生長，阻遏惡性腫瘤的進展[20]。人類MDM2同源基因是一種可在多種腫瘤細胞中高表達的E3泛素連接酶，它能與p53結合并輔助p53在腫瘤細胞中發生降解，被認為是調節p53降解最重要的一種泛素連接酶，是p53的抑制因子。從分子結構來看，在降解p53的過程中，MDM2的RING結構域起到了主要作用，而TRIM59在其N末端也有著類似的RING結構域，這種結構相似性表明TRIM59和MDM2在對p53的調控中可能也有著類似的機制。因此推測，在HCC中TRIM59的RING結構域可能與p53存在著某種關聯，促使p53發生降解。高表達的TRIM59可能通過上述途徑降解p53，p53低表達失去對HCC細胞的抑制作用而導致腫瘤細胞生長；相反，低表達的TRIM59不足以降解p53，p53高表達調控腫瘤細胞增殖、抑制了HCC的進展。

綜上所述，HCC細胞中TRIM59 mRNA及蛋白高表達；上調TRIM59表達，HCC增殖能力增強、p53低表達，下調TRIM59表達則HCC增殖能力減弱、p53高表達；TRIM59對HCC細胞增殖的影響可能是通過調節p53表達實現的。具體影響機制仍有待進一步研究。