不同濃度脫脂牛血清白蛋白對人外周血單個核細胞NLRP3炎癥通路相關蛋白表達的影響

童曉霞，周京國

1南充市中心醫院，四川南充637000；2成都醫學院附屬第一醫院

牛血清白蛋白(BSA)是研究高分子蛋白質的體內代謝、生物學功能、臨床應用等的理想蛋白質[1]，還可作為脂肪酸、金屬離子、有機小分子燃料、代謝物及各類藥物的運載體，并用于細胞培養。BSA存在固有免疫反應性，經BSA處理的人脂肪細胞中IL-6、IL-8、TNF-α表達增加[2]。在研究脂肪酸與NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎性體信號通路時，作為脂肪酸運載體的脫脂BSA是否對NLRP3炎癥通路中NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)、白細胞介素1β(IL-1β)基因表達有影響，目前仍不明確。本研究觀察了不同濃度脫脂BSA對人外周血單個核細胞(PBMCs)中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β mRNA表達的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選擇2018年10～12月在川北醫學院附屬醫院體檢中心體檢的30例健康體檢者，男16例、女14例，年齡18～50歲，體質量指數18.5～23.9 kg/m2。采集受試者空腹外周靜脈血28 mL，肝素鈉抗凝，綠色生化管分成4 mL/管，共7管。

1.2 脫脂BSA溶液的配制 稱取適量脫脂BSA(純度>99%)，加入PBS充分溶解、混勻，經0.22 μm的濾膜過濾除菌，-20 ℃保存備用。

1.3 外周血標本分組與脫脂BSA干預 將外周血標本分為BSA組及空白對照組。BSA組加入PBS稀釋的脫脂BSA溶液，使其終濃度分別為0.312 5%、0.625%、1.25%、2.5%、5%、10%；空白對照組加入等量PBS。置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育6 h。然后3 000 r/min離心5 min，分離血漿，血細胞加入人淋巴細胞分離液，提取PBMCs。

1.4 PBMCs中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。相關基因引物序列見表1。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。

表1 NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β mRNA及內參引物序列

2 結果

BSA組加入1.25%、2.5%、5%、10%脫脂BSA后，IL-1β mRNA相對表達量高于空白對照組(P均<0.05)。BSA組加入1.25%、2.5%、5%、10%脫脂BSA后，ASC mRNA相對表達量低于空白對照組(P均<0.05)。BSA組NLRP3、Caspase-1 mRNA與空白對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。詳見表1。

表1 各組IL-1β、ASC、NLRP3、Caspase-1 mRNA表達比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

3 討論

BSA廣泛用于生化實驗中,如Western blotting實驗、PCR實驗[6]。在動物細胞無血清培養液中添加BSA可起到維持滲透壓和pH緩沖、載體及營養作用[7]。BSA存在固有免疫反應性，BSA的構象和線性表位是過敏反應的有效誘導劑[8]。研究顯示，BSA表位能夠被來自致敏受試者的致敏IgE完全識別，并且能夠誘導T細胞增殖[8，9]。Ding等[10]研究表明，BSA可直接激活人腎小管上皮HK2細胞中的NLRP3炎性體；BSA過載可誘導蛋白尿和顯著的腎小管間質炎癥，表現為CD20+細胞(B淋巴細胞)、CD3+細胞(T淋巴細胞)、CD68+細胞(巨噬細胞)浸潤。BSA過載顯著增加近端小管上皮細胞和炎癥細胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表達。

NLRP3是NLRP亞家族的典型代表，當NLRP3的富含亮氨酸的重復序列(LRR)結構域與其配體結合后使處于自我抑制、無活性狀態的NLRP3發生構象變化，暴露出NACHT結構域(又稱NOD結構域)，通過ATP聚合形成高度有序的NLRP3蛋白寡聚體，并募集ASC及半胱天冬酶1酶原(Pro-Caspase-1)形成NLRP3炎性體。NLRP3炎性體激活Pro-Caspase-1產生活化的Caspase-1，活化的Caspase-1能將胞內不具活性的IL-1β前體形成活化的成熟IL-1β分泌到胞外，產生炎癥和免疫反應[11]。

NLRP3炎性體可以被多種外源性病原相關分子模式(如病毒、細菌、真菌等)及內源性損傷相關分子模式(如胞外ATP、UA等)通過不同途徑激活，但其激活機制尚不清楚[12]。目前多數研究認為，各種體內外的刺激因素可以通過細胞內鉀離子外流、溶酶體膜破裂后組織蛋白酶B釋放、活性氧產生這3種模式激活NLRP3炎性體[13]。BSA作為一種白蛋白，可以通過激活腎小管上皮細胞內的NLRP3炎性體，活化Caspase-1，釋放IL-1β和IL-18，引起腎小管間質炎癥反應[14]。丁麗紅等[15]報道，白蛋白可激活腎小管上皮細胞NLRP3炎性體，促進IL-1β mRNA及IL-1β蛋白表達增加，其機制可能與組織蛋白酶B釋放和活性氧生成有關。

本研究結果顯示，一定濃度的脫脂BSA刺激PBMCs，能夠上調IL-1β mRNA表達、下調ASC mRNA表達，而同樣濃度的脫脂BSA對NLRP3、Caspase-1 mRNA表達無明顯影響。這提示脫脂BSA刺激PBMCs可能激活了NLRP3炎性體，引起IL-1β mRNA表達上調，但其具體激活機制尚不明確。ASC mRNA表達下調以及NLRP3、Caspase-1 mRNA表達未見影響，可能與刺激6 h后啟動了機體內的負性調控機制有關，如miR-223對NLRP3的負性調控[16]。自噬在NLRP3炎性體激活中也起關鍵作用。自噬作為NLRP3炎性體激活的負調節因素通過各種機制起作用，包括通過去除內源性NLRP3炎性體激動劑的來源直接抑制NLRP3炎性體激活和選擇性降解炎性體成分。此外，TNF-α誘導的蛋白3是一種NF-κB信號轉導抑制劑，可作為NLRP3激活和Caspase-1加工的負調節因子；芳烴受體與NLRP3啟動子中的外源性反應元件結合并抑制NLRP3轉錄；NO和3,4-亞甲二氧基-β-硝基苯乙烯通過靶向NLRP3復合體抑制ASC的形成[17]。

本研究顯示1.25%～10%的脫脂BSA刺激人外周血PBMCs 6 h能夠上調細胞中IL-1β mRNA表達、下調ASC mRNA表達。在實驗中使用脫脂BSA時，需排除脫脂BSA本身對細胞中上述基因表達的影響，避免研究結果的偏差。