改良電抽搐療法治療精神分裂癥的生物學機制探討

王萍，劉可智，向波，譚清宇，陳德超，梁雪梅

1西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000；2宜賓市第四人民醫院

精神分裂癥是最常見的重型精神病之一，抗精神病藥物是其基礎治療方法。復雜的遺傳性缺陷是精神分裂癥發病的最大已知風險因素。改良電抽搐療法(MECT)是一種安全、有效、快速的精神疾病物理治療方法[1]，目前認為治療急性精神分裂癥有效，疾病緩解率達60%[2]。越來越多的研究表明，MECT聯合抗精神病藥物治療精神疾病效果顯著[3]。MECT的治療機制與多種分子途徑有關。有學者在大鼠實驗中發現BRD1 mRNA表達變化可能與MECT的療效有關[4]。另一項研究表明，轉錄因子(TCF)家族可能在MECT治療中發揮作用[5]。還有研究發現腦源性神經營養因子(BDNF)可能是精神病易感性生物學途徑中的下游基因[6]。然而，MECT治療精神分裂癥的機制仍不明確。第二代測序(NGS)法加速了疾病病理學的研究進程，產生了新的研究方向，如基因組學、轉錄組學、基因表達分析等[7]。本研究對采用MECT治療的精神分裂癥患者進行療效評估，通過Illumina測序法及生物信息學方法，分析不同MECT治療反應者表達差異基因，并進行GO富集分析、KEGG通路功能富集分析、疾病相關分析、藥物相關分析、表型分析和全表型組關聯分析，初步探討MECT治療精神分裂癥的生物學機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年11月～2019年1月宜賓市第四人民醫院住院精神分裂癥患者16例進入研究。入選標準：①符合精神疾病診斷和統計手冊(DSM)5的診斷標準；②接受MECT治療(≥6次，3次/周)；③年齡15～55歲，右利手，漢族；④小學畢業及以上文化。排除標準：①患有嚴重軀體疾病，神經系統疾病，物質依賴者；②入組時被診斷為精神分裂癥，在隨訪6個月后不能確定為精神分裂癥或診斷為其他精神障礙患者。選擇年齡、性別、學歷等一般資料相匹配的健康志愿者8例為正常對照組。排除患有精神障礙和人格障礙者，患器質性精神障礙、神經系統疾病、物質依賴者，二系三代精神疾病家族史陽性者，曾服用過抗精神病藥、抗抑郁藥者。受試者均自愿加入本研究，并簽署知情同意書。本研究由西南醫科大學附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 療效評估及分組 采用DSM-Ⅳ的定式檢查工具SCID-I/P(患者版)及SCID-NP(非患者版)分別對入組患者和正常對照組進行系統精神檢查。采用陽性和陰性癥狀量表(PANSS)評估臨床療效，要求病例組基線分數≥60分，并計算MECT治療后減分率。減分率=(治療前評分-治療后評分)/(治療前評分-30)×100%。將病例組根據減分率分為治療應答組8例(減分率≥60%)、治療無應答組8例(減分率<60%)。治療應答組男、女各4例，年齡(31.63±6.28)歲，學歷為初中5例、高中及以上3例，基線PANSS(83.63±7.11)分；治療無應答組男、女各4例，年齡(34.69±11.01)歲，學歷為小學3例、初中2例、高中及以上3例，基線PANSS(89.13±9.00)分；正常對照組男、女各4例，年齡(31.25±11.22)歲，學歷為小學2例、初中3例、高中及以上3例。三組一般資料具有可比性。治療應答組和治療無應答組用藥方案及基線PANSS差異無統計學意義。

1.3 外周血RNA提取及測序 分別于MECT治療前和治療后1～3 d清晨(07:00～09:00)采集各組受試者全血2 mL，使抗凝劑與血液混勻，按250 μL/管分裝于單獨凍存管中，加750 μL的TRIzol混勻，液氮速凍(≥1 h)后轉移至-80 ℃保存。正常對照組僅采血1次。7～10 d內提取總RNA。用Nanodrop2000檢測RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，Agilent2100測定RIN值。單次建庫要求RNA總量1≥μg，濃度≥50 ng/μL，OD260/280為1.8～2.2。從總RNA中分離出mRNA，加入裂解液(fragmentation buffer)將mRNA隨機斷裂成300 bp左右的小片段，在逆轉錄酶的作用下逆轉錄合成cDNA。加入End Repair Mix將雙鏈cDNA的黏性末端補成平末端，隨后在3′末端加上腺嘌呤(A)堿基。用PCR擴增15個循環，2%低量程超瓊脂糖回收目的條帶，按數據比例混合上機，在cBot上進行橋式PCR擴增并進行Illumina Hiseq測序(PE文庫，讀長2×150 bp)。使用fastx_toolkit_0.0.14軟件對每個樣本的原始測序數據進行質控，將質控后的原始數據與參考基因組比對獲得用于后續轉錄本組裝、表達量計算等的映射數據(mapped Reads)，同時運用TopHat2(http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml)和HISAT2(http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)軟件對該次轉錄組測序的比對結果進行質量評估，包括測序飽和度、基因覆蓋度、數據(Reads)在參考基因組不同區域分布及Reads在不同染色體分布分析。

1.4 差異表達基因篩選 基于所選參考基因組序列，使用StringTie軟件對Mapped Reads進行拼接并與原有基因組注釋信息進行比較，發掘新基因，補充和完善原有基因組注釋信息。將基因與六大數據庫(NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG)進行比對，對基因的表達水平進行定量分析。獲得基因的表達量后，使用DESeq2軟件進行樣本間基因的差異表達分析，用FDR(Benjamini/Hochberg法)進行多重檢驗矯正，篩選校正P<0.05者作為差異表達基因。分別獲得病例組治療前與正常對照組、治療應答組治療前后、治療無應答組治療前后的差異表達基因。

1.5 重疊基因功能富集分析 將“1.4”中篩選的病例組治療前與正常對照組、治療應答組治療前后、治療無應答組治療前后的差異表達基因進行對比分析，獲得重疊基因，并根據基因表達水平的變化分為表達上調組和表達下調組，用WebGestalt(http://www.webgestalt.org)軟件[8]分別對表達上調組和表達下調組的重疊基因進行功能富集分析即GO分析、KEGG通路分析、疾病相關分析、藥物相關分析表型分析(哺乳動物、人類表型)、全表型組關聯分析(即PheWAS)。以adjP<0.05作為篩選標準，選擇每項分析中校正P值最低的前5項作為富集結果。

2 結果

2.1 差異表達基因分析結果 病例組治療前與正常對照組差異表達基因4 964個，表達上調2 618個、下調2 346個。治療無應答組治療前后未發現差異表達基因。治療應答組治療前后差異表達基因343個，表達上調129個、下調214個。將病例組治療前與正常對照組差異表達基因、治療應答組治療前后差異表達基因進行對比分析，發現176個重疊基因，其中表達上調55個(ABCA13、SPTY2D1、ZNF654、EDEM3、USP38、SEC24A、PIK3CG、SMC4、LMBRD2、DENND1B等)，下調121個(VASH1-AS1、AC135050.1、SLC5A2、PPP1R14A、AC006213.1、AL021707.5、ETFB、HRAS、SIRT6、ZNF337-AS1等)。

2.2 差異表達基因GO富集分析結果 在重疊基因中，表達上調組顯著富集于生物學功能，涉及磷脂酰肌醇二磷酸激酶活性、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸-3-激酶活性、胰島素受體底物結合、磷脂酰肌醇-3-激酶活性、1-磷脂酰肌醇-3-激酶活性；表達下調組顯著富集于細胞組分，包括核糖體亞單位、核糖體結構、核糖體、胞質核糖體和結構分子活性的生物學功能。見表1。

表1 差異表達基因的GO富集分析

2.3 差異表達基因KEGG通路分析結果 表達上調的差異表達基因主要與慢性粒細胞白血病、腎細胞癌、神經營養因子信號通路、丙型肝炎、白細胞內皮遷移通路有關，表達下調基因主要與核糖體、亨廷頓病、類風濕關節炎、緊密連接、哮喘生物通路有關。見表2。

表2 差異表達基因KEGG通路分析

2.4 差異表達基因疾病相關分析 重疊的差異表達基因表達上調者與共濟失調有關(校正P=0.045)，表達下調基因與HIV有關(校正P=0.023)。

2.5 差異表達基因藥物相關分析 未發現重疊的差異表達基因與藥物有顯著關聯。

2.6 差異表達基因表型分析 重疊的差異表達基因表達上調者與腎發育不全、眼球突出、房間隔缺損、外周動脈異常、動脈狹窄顯著相關。見表3。

2.7 全表型組關聯分析 重疊的差異表達基因表達上調者與心房顫動和撲動、血壓升高、細菌感染、女性生殖器相關癥狀、維生素B復合物缺乏有關。表達下調基因與腸道吸收不良有關。

表3 差異表達基因的表型分析

3 討論

雖然已有研究發現了一些能預測MECT對精神分裂癥療效的生物學標志物，但其生物學機制至今尚不清楚。研究者通過動物模型或精神分裂癥患者對各種神經遞質、受體及激素進行了廣泛的探索，發現了與MECT抗精神病效應有關的因素，并形成了眾多的假說，如神經營養作用、中樞免疫系統調節、神經再生等。腦源性神經營養因子在成年期神經細胞的存活、分化、維持和連接中起著重要作用，也參與應激反應中下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能。MECT后的精神分裂癥患者血清BDNF水平升高，且臨床癥狀得到改善。有學者通過探究MECT對血清中細胞因子水平的影響，來闡明免疫功能在MECT療效中的重要作用。已有多項研究顯示，精神分裂癥患者MECT前后血液中某些蛋白水平發生改變且與臨床癥狀相關，但從基因轉錄水平去探索MECT治療精神分裂癥機制的研究極少。本研究通過分析精神分裂癥患者MECT前后外周血mRNA轉錄水平的差異，探索MECT治療精神分裂癥的生物學機制。

本研究發現，MECT聯合抗精神病藥物治療精神分裂癥療效顯著，這與先前的研究一致[9]。對病例組治療前與正常對照組、治療應答組治療前后、治療無應答組治療前后的差異表達基因進行對比分析，發現176個重疊的差異表達基因，其中表達上調55個(ABCA13、SPTY2D1、ZNF654、EDEM3、USP38、SEC24A、PIK3CG、SMC4、LMBRD2、DENND1B等)，下調121個(VASH1-AS1、AC135050.1、SLC5A2、PPP1R14A、AC006213.1、AL021707.5、ETFB、HRAS、SIRT6、ZNF337-AS1等)。重疊基因GO富集分析發現，表達上調基因顯著富集于磷脂酰肌醇激酶活性，與相關研究一致[10]。有研究發現磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶Ⅱa(PIP5K2A)在異源基因表達系統中調節神經元kcnq2/kcnq3和kcnq3/kcnq5通道功能，從而導致精神分裂癥相關突變體(N251S)-PIP5K2A被破壞，有助于精神分裂癥癥狀緩解[11]。現有臨床和臨床前期數據表明，MECT治療精神分裂癥的療效可能與部分激活磷脂酰肌苷3-激酶-蛋白激酶B途徑(PI3K-PKB)通路有關。表達下調基因主要富集于核糖體，與核糖體蛋白S28、L28、P2、S9、S19、L36顯著相關，而人類基因組核糖體基因復制數升高導致的rRNA失調可能是精神分裂癥發展的遺傳因素之一[12]。

KEGG通路分析顯示，表達上調基因與神經營養因子信號通路相關，主要由SH-PTP2和PI3K介導。神經營養因子在神經元生長、可塑性和存活的信號通路中起重要作用。研究表明，MECT可導致海馬組織體積增加，其機制可能與神經發生、膠質生成、突觸形成、血管生成相關，而神經營養因子似乎在這些過程中起著重要的中介作用[13]。神經營養因子相關的細胞內信號通路在精神分裂癥等神經精神疾病的病理生理學過程中至關重要[14]。神經營養因子信號通路中的PIK3CG、PIK3CA、PTPN11參與神經網絡形成的關鍵階段。SH-PTP2是一種參與多種信號轉導途徑的多功能酪氨酸磷酸酶，在神經系統中分布廣泛，參與介導神經元存活的途徑，也是多種神經反應的重要參與因子。調控PI3K/Akt信號通路有助于保護神經功能，促進血管生成[15]。我們推測MECT通過調節神經營養因子信號通路而產生療效。未來研究可從神經營養因子的生物學、表觀遺傳調控及其在發育過程中的相互作用方面作進一步探索[16]。表達下調基因與亨廷頓病通路相關，與通路中亨廷頓基因(HTT)顯著相關。亨廷頓病的發病機制與HTT序列中CAG三核苷酸擴增有關。小鼠實驗表明，電休克治療可通過刺激腦源性神經營養因子產生、保護神經元免受應激、減少突變型HTT對紋狀體神經元的損害，從而延緩亨廷頓疾病的發展。未來的研究可探索精神分裂癥與HTT的關聯。同時，表達下調基因也與緊密連接通路相關。緊密連接通路與谷氨酸能、γ-氨基丁酸能突觸的形成和神經傳遞有關，在緊密連接途徑中TNNA1和MYH2基因的高甲基化也參與了神經管缺陷的發生[17]。

疾病相關分析發現，表達下調的差異表達基因與HIV顯著相關。HIV患者患精神分裂癥的風險更高，且能增加病死率[18]。精神分裂癥與HIV具有正相關的遺傳關系，因為兩者拮抗性多效性的單核苷酸多態性鑒定的基因功能富集于突觸傳遞和神經遞質傳遞的調節[19]。重疊基因表型分析和全性狀組關聯分析顯示，差異表達基因與心血管疾病及癥狀相關，如動脈狹窄、心房顫動和撲動等。心血管疾病是精神分裂癥患者過早死亡的最常見原因，精神分裂癥的陰性癥狀可增加心血管疾病風險[20]。MECT對精神分裂癥患者心律的影響可能與麻醉藥物的使用有關。

綜上，本研究發現藥物聯合MECT治療精神分裂癥療效顯著。MECT治療精神分裂癥的機制可能與調節神經元通路、促進神經元生長、存活和可塑性、調節突觸傳遞和神經遞質有關。未來的研究可從大腦內部基因差異表達探索MECT治療精神分裂癥相關的生物機制。本研究也存在一定局限性，如在MECT治療過程中藥物使用可能會對結果產生影響、基于外周血基因表達差異并不能反映大腦組織中基因表達的變化、樣本量較小等，未來我們還將進一步擴大樣本量，深入研究MECT的治療機制。