山慈菇提取物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)的影響

唐純明，何自力，李軍

湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院 湖南省人民醫(yī)院，長沙431000

肝癌具有生長迅速、侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)、惡性度高、預(yù)后差等特點(diǎn)[1]，尋找治療肝癌的有效藥物迫在眉睫。山慈菇為常用抗腫瘤中藥之一，是蘭科植物中的干燥假鱗莖聚生，具有燥濕化痰、消腫和軟堅(jiān)散結(jié)等作用[2～4]。近年來多項(xiàng)研究顯示，山慈菇有廣泛的抗腫瘤、抗炎、抑制血管生成以及抑制瘢痕增生等作用，但其抗肝腫瘤作用機(jī)制尚未完全闡明[3]。炎癥因子TNF、IL-1β、IL-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶2(COX-2)可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增殖和凋亡，參與腫瘤的發(fā)病[5～7]。IL-1β和IL-6在正常情況下表達(dá)水平較低，腫瘤狀態(tài)下可誘導(dǎo)其高表達(dá)[8,9]。2017年6月～2019年3月，本研究觀察了山慈菇提取物對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖及TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)的影響，從炎癥反應(yīng)角度探討山慈菇提取物的抗腫瘤機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，編號(hào)TCHu52。山慈菇購于北京同仁堂藥店。山慈菇提取物的配制參照文獻(xiàn)[10]，將山慈菇水煎劑配制成1.5 g/mL的儲(chǔ)備液，分裝后于4 ℃儲(chǔ)存待用。FBS和DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司。PBS、CCK-8試劑盒、青霉素-鏈霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)、結(jié)晶紫染色液、TRIzol試劑購自北京索萊寶科技有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。實(shí)驗(yàn)所需引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒購自Elascience公司。CO2培養(yǎng)箱、MB-530酶標(biāo)儀購自BIOBASE公司。奧林巴斯倒置顯微鏡購自上海普赫光電公司。Nanodrop2000型超微量分光光度計(jì)購自美國Thermo公司。Mx3000P型熒光定量PCR儀購自美國Agilent公司。

1.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) SMMC-7721細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2條件培養(yǎng)箱中，在含10% FBS和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞，在96孔板中分別加入含0、100、200、400、600、800、1 000 mg/L山慈菇提取物的完全培養(yǎng)液100 μL，分別于培養(yǎng)24、48、72 h后加入CCK-8試劑測(cè)算細(xì)胞增殖能力。0、100、200 mg/L的藥物作用24、48、72 h細(xì)胞增殖抑制率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。400、600、800、1 000 mg/L的藥物作用24、48、72 h細(xì)胞增殖抑制率高于0 mg/L者，600、800、1 000 mg/L的藥物作用24、48、72 h細(xì)胞增殖抑制率高于400 mg/L者(P均<0.05)。見表1。選取質(zhì)量濃度為400、600、800 mg/L的山慈菇提取物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度山慈菇提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

注：與同時(shí)點(diǎn)0 mg/L組相比，*P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)400 mg/L組相比，#P<0.05。

1.3 細(xì)胞克隆形成能力觀察 取對(duì)數(shù)生長期SMMC-7721細(xì)胞，以5×102/孔接種于6孔板中，分為0 mg/L組、400 mg/L組、600 mg/L組、800 mg/L組，分別加入0、400、600、800 mg/L的山慈菇提取物處理24 h，更換常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)14 d。用PBS洗滌6孔板中細(xì)胞2次，100%的甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫液染色15 min，PBS洗去染色液，拍照，觀察克隆形成情況，計(jì)算克隆形成率。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 取對(duì)數(shù)生長期SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，按“1.3”方法分組并處理。培養(yǎng)24 h后，光學(xué)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.5 細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA檢測(cè) 將SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔板中，待培養(yǎng)后，按“1.3”方法分組并處理，收集細(xì)胞，用TRIzol法收集細(xì)胞總RNA，并測(cè)定濃度。TNF-α mRNA上游引物序列為5′-GCTGCACTTTGGAGTGATCG-3′、下游引物序列為5′-GAGGGTTTGCTACAACATGGG-3′，長度140 bp；IL-1β mRNA上游引物序列為5′-AGAAGTACCTGAGCTCGCCA-3′、下游引物序列為5′-CTGGAAGGAGCACTTCATCTGT-3′，長度106 bp；IL-6 mRNA上游引物序列為5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′、下游引物序列為5′-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′，長度149 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′、下游引物序列為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，長度258 bp。嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR反應(yīng)。以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-1β、IL-6、TNF-α檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長期SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按“1.3”方法分組并處理，24 h后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，采用ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

2 結(jié)果

2.1 各組SMMC-7721細(xì)胞克隆形成能力比較 0、400、600、800 mg/L組克隆形成率分別為100%、76.12%±8.12%、43.43%±6.54%、27.69%±3.38%。400、600、800 mg/L組細(xì)胞克隆形成率低于0 mg/L組，600、800 mg/L組克隆形成率低于400 mg/L組(P均<0.05)。

2.2 各組SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)變化 0 mg/L組細(xì)胞排列緊密，呈梭形，形態(tài)飽滿，邊界清楚；而400、600、800 mg/L組隨著藥物濃度增大，細(xì)胞形態(tài)皺縮，貼壁差，細(xì)胞易脫落，尤以800 mg/L組最明顯。見圖1。

注：A、B、C、D分別為0、400、600、800 mg/L組。

圖1 山慈菇提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3 各組SMMC-7721細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)比較 400、600、800 mg/L組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)低于0 mg/L組，600、800 mg/L組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)低于400 mg/L組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組SMMC-7721細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)比較

注：與0 mg/L組相比，*P<0.05；與400 mg/L組相比，#P<0.05。

2.4 各組SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 400、600、800 mg/L組細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于0 mg/L組，600、800 mg/L組TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于400 mg/L組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

注：與0 mg/L組相比，*P<0.05；與400 mg/L組相比，#P<0.05。

3 討論

山慈菇味辛苦，性微寒，普遍存在于自然界中。其獲取較容易，毒性小，常用于治療炎性水腫、燥熱型矽肺和急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，還具有抑制瘢痕增殖、防止組織粘連形成、提高機(jī)體免疫力和護(hù)肝等多種作用[2,11]。山慈菇對(duì)多種腫瘤如乳腺癌、甲狀腺癌、食管癌、胃癌和大腸癌等具有抑制作用[2,10,12,13]。關(guān)于山慈菇提取物抗肝癌細(xì)胞就增殖的作用及其具體機(jī)制尚未充分闡明。本研究以山慈菇提取物作用于肝癌SMMC-7721細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能有效抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖活性，并且呈一定的時(shí)間和濃度依賴性。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，SMMC-7721細(xì)胞在不同濃度山慈菇提取物作用下，細(xì)胞克隆形成能力明顯降低。而且，SMMC-7721細(xì)胞在不同濃度山慈菇提取物作用后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化，包括細(xì)胞變圓、皺縮，貼壁能力差，細(xì)胞易脫落，而且藥物濃度越高，細(xì)胞脫落越明顯。這進(jìn)一步說明山慈菇提取物具有抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖的作用。

TNF-α是炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)因子，生理狀態(tài)下有助于增強(qiáng)免疫力和抑制腫瘤生長，但當(dāng)超過一定量時(shí)可增大和加重炎癥反應(yīng)，引起多種病理損傷，促進(jìn)腫瘤增殖[6]。研究表明，TNF-α參與人乳頭瘤病毒感染后的機(jī)體免疫防御，TNF-α高表達(dá)可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展和腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)[14]。李京濤等[15]觀察了益脾養(yǎng)肝方對(duì)肝癌前病變大鼠血清TNF-α和IL-6水平的影響，發(fā)現(xiàn)該藥可抑制肝癌癌前病變大鼠病情進(jìn)展，可能是通過降低TNF-α和IL-6的表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)的。還有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌化療后患者血清中TNF-α、IL-6水平低于確診未治的肝癌患者[16]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)山慈菇提取物作用后，SMMC-7721細(xì)胞中TNF-α mRNA表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞分泌TNF-α減少，提示山慈菇提取物可能抑制了TNF-α的表達(dá)與分泌。

腫瘤微環(huán)境主要是由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、炎癥因子等相互作用而形成的，受多階段、多因素調(diào)控[17]。IL-1家族中，IL-1β與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系最為密切，是機(jī)體調(diào)控炎癥反應(yīng)與免疫應(yīng)答的重要因子[18]。近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β作為腫瘤免疫重要因子之一，其在肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中高水平表達(dá)[19,20]。IL-1β可能通過啟動(dòng)腫瘤增殖和抗凋亡等途徑參與多種惡性腫瘤的疾病進(jìn)程。IL-6也是一種促炎細(xì)胞因子，是連接腫瘤與炎癥的關(guān)鍵炎癥因子[21,22]。在致癌物誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中，血清IL-6水平升高，而薏苡仁提取物能明顯降低血清IL-6水平，并且能有效抑制成瘤率。也有研究發(fā)現(xiàn)，辣椒堿對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，有可能與其抑制細(xì)胞中IL-6的表達(dá)與分泌有關(guān)[23]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)山慈菇提取物作用后，SMMC-7721細(xì)胞中IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)和IL-1β、IL-6分泌水平均明顯降低，提示山慈菇提取物的增殖抑制作用可能與抑制IL-1β、IL-6的表達(dá)和分泌有關(guān)。

綜上所述，山慈菇提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用，還可抑制細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)與分泌。山慈菇提取物可能通過抑制炎癥因子分泌，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。通過山慈菇提取物干預(yù)TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)與分泌有望成為肝癌等腫瘤疾病治療的新策略。關(guān)于山慈菇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及炎癥因子表達(dá)抑制作用所涉及的具體信號(hào)通路，還有待進(jìn)一步探索。