甘藍型油菜苗期抗旱性鑒定及抗旱生理指標的評價

左凱峰,郭 娜,張冰冰,秦夢凡,馬 寧,劉 翔,李青青,黃 鎮,徐愛遐

(西北農林科技大學農學院，陜西 楊凌 7121000)

關鍵字：甘藍型油菜；苗期；抗旱鑒定；抗旱生理指標

甘藍型油菜是我國的主栽油菜類型，如何提高菜籽油的產量和品質是油菜育種的主要目標，干旱是影響油菜產量的重要非生物脅迫[1]。我國甘藍型油菜的主產區經常受秋冬旱和春旱而影響油菜的產量和品質。因此，選育抗旱性強的甘藍型油菜品種成為一個重要的育種目標。

國內外學者對小麥、玉米、大豆、水稻等糧食作物的耐旱性進行了大量的研究[2-8]。作物對干旱的響應主要有耐旱和避旱兩種機制[9]，避旱即通過調節生育期避開環境干旱的時期，近年來研究最多的是耐旱機制。耐旱性是許多獨立的形態和生理性狀相互作用的結果，因此，對作物耐旱性的評價指標也有很多，如葉片含水量、地上部干重、離體葉片保水力、丙二醛含量、相對電滲漏以及各種滲透調節物質等。Mao等[10]研究表明葉片中脯氨酸含量可作為甘藍型油菜滲透調節能力的指標；張弢[11]采用Hoagland營養液水培法，以不同濃度 PEG-6000處理油菜幼苗，研究表明隨著 PEG處理濃度的增加，油菜幼苗葉片中可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量總體呈上升趨勢，葉綠素和可溶性蛋白含量先增后降，脯氨酸及丙二醛含量等是與油菜抗旱性相關的生理指標。

油菜抗旱性是一個復雜數量性狀，除與品種自身特性有關外，還受到多個生理過程的調控，但目前針對甘藍型油菜苗期生理指標抗旱性綜合評價的研究還鮮見報道。本研究選擇在西北地區種植的120個甘藍型油菜種質為試驗材料，采用PEG溶液模擬干旱法，篩選抗旱材料，為甘藍型油菜抗旱育種提供材料支持，同時對各抗旱生理指標進行評價，得出與甘藍型油菜抗旱密切相關的生理指標，為甘藍型油菜抗旱性快速鑒定提供新途徑。中國油菜主產區的秋冬旱常發生在油菜苗期，且在苗期進行抗旱性鑒定具有所需時間短、鑒定容量大、試驗重復性強、對環境影響小等優點[12]，所以本試驗選擇在苗期進行。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試油菜種質為西北農林科技大學農學院油菜育種課題組培育和收集的120份甘藍型油菜骨干種質。

1.2 試驗方法

試驗于2018年7—8月在西北農林科技大學農學院人工氣候室進行，人工氣候室設置程序為16 h/8 h晝夜交替，晝/夜溫度設為：23℃/19℃，設定室內濕度為60%。首先將供試120份甘藍型油菜種質種植于50孔穴盤中，土壤采用天豐園藝生產的V9育苗基質，每個品種20株，待油菜幼苗長至5葉期，將幼苗的根用清水輕輕洗凈，轉移至Hoagland營養液中培養，設為2個重復，每個重復10株，浮板株距為8 cm，在營養液中培養6 d后(每3 d更換一次營養液)，其中一個處理加入PEG-6000使其最終濃度為6%，另一處理作為對照。處理48 h后對各品種的處理以及對照取樣，并觀察處理組受到干旱脅迫情況，并分等級記錄。

1.3 抗旱性鑒定及指標測定

1.3.1 油菜樣品采集 對各個種質的第三片葉片進行取樣，3株混樣為一個重復，共3個重復，將取下的葉片用錫箔紙包好立即放入-80℃冰箱。

1.3.2 PEG脅迫下抗旱指數計算 依據肖慶生[13]的抗干旱指數的計算方法對各個品種的抗旱情況分級并計算抗旱指數，旱害等級分為5級，各級標準如下(表1)。

表1 旱害調查分級標準[13]

抗干旱指數(DRI,%)=1-{[100%×(1×S1+2×S2+3×S3+4×S4)]/(調查的總植株數×4)}； 其中，S1、S2、S3、S4 分別代表1～4級干旱的油菜植株數。參考肖慶生[13]的分類標準并結合本試驗情況,抗旱等級計算標準：高感(HS):0%≤抗旱指數≤15.0%；低感(LS)：15.0%<抗旱指數≤30.0%；低抗(LR)：30.0%<抗旱指數≤40.0%；中抗(MR)：40.0%<抗旱指數≤50.0%；高抗(HR)：50.0%<抗旱指數≤85.0%。

1.3.3 生理指標的測定 依據植物生理學實驗指導[14-15]測定各個品種的SPAD值、葉片含水量、地上部干重以及葉片保水力；測定處理以及對照組的可溶性蛋白含量、丙二醛含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量等生理指標。葉片保水力采用稱重法[14]，可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250法[14]，丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸法[15]，蒽酮法測定可溶性糖含量[14]，茚三酮比色法測定脯氨酸含量[15]；計算得到該材料受到干旱脅迫48 h后相對于對照組各生理指標的變化量。

1.4 數據統計分析

利用WPS軟件整理數據、分析匯總數據。使用Spss 20.0軟件對試驗數據進行統計繪圖、方差分析、各指標間相關性分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 PEG脅迫下120份甘藍型油菜苗期抗旱性鑒定

據肖慶生[13]的方法統計、計算得到抗旱指數，120份甘藍型油菜種質中，抗旱指數最大為85%，最小為0%，平均抗旱指數為26.3%。120份甘藍型油菜的抗旱情況見表2，圖1。其中高抗材料6份，占供試材料的5.0%；中抗材料10份，占供試材料的8.3%；低抗材料23份，占供試材料的19.17%；低感材料42份，占供試材料的35.0%；高感材料39份，占供試材料的32.5%。

2.2 PEG脅迫下不同油菜種質抗旱生理指標的變化

PEG模擬干旱處理下，不同甘藍型油菜種質的生理變化不同(圖2)，其中SPAD值相對于對照的變化量最大為16.1，最小為-17.3，相對于對照平均降低1.2%，說明受到干旱脅迫后油菜葉片的葉綠素含量降低；油菜幼苗葉片含水量主要集中在81%～85%，其中最大為88%，最小為74%。各個品種(系)離體葉片保水力差異較為明顯，其中最大的可達最大含水量的90%，而最小的僅有37%左右。干旱脅迫后葉片中可溶性蛋白含量相對于對照的變化量最大為6 500 μg·g-1左右，最小為-2 500 μg·g-1，相對于對照平均增加了97.5%。絕大多數材料在受到干旱脅迫后丙二醛含量增加，平均增加量為11.74 μmol·g-1，相對于對照平均增加了107.6%，說明受到干旱脅迫之后油菜葉片丙二醛含量顯著升高。可溶性糖變化量最大為16 000 μg·g-1，最小為-7 000 μg·g-1，相對于對照平均增加了94.7%。脯氨酸含量相對于對照變化量在100 μg·g-1左右，但品種間差異較大，最大增量可達1 400 μg·g-1，最小的在-10 μg·g-1左右，相對于對照平均增加了432.8%，說明受到干旱脅迫后油菜體內脯氨酸含量對干旱反應最為靈敏。不同的甘藍型油菜種質在受到干旱脅迫下，各生理指標存在著明顯差異，為甘藍型油菜抗旱材料的篩選利用以及抗旱基因的挖掘創造了條件。

2.3 抗旱指數與各生理指標間的相關性分析

抗旱指數與8個抗旱生理指標之間的相關性分析結果表明(表3)，在干旱脅迫下，不同甘藍型油菜種質的抗旱指數與可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量呈極顯著正相關，相關系數分別是0.521**，0.506**和0.495**；與丙二醛含量呈極顯著負相關，相關系數為-0.372**；抗旱指數與離體葉片保水力有極顯著的正相關關系，相關系數為0.426**，與SPAD值(0.172)、葉片含水量(0.118)和地上部干重(0.12)呈正相關，但不顯著。此外，可溶性糖與脯氨酸(0.240**)、可溶性蛋白與可溶性糖(0.252**)、葉片保水力與葉片含水率(0.364**)也有極顯著相關關系。

表2 120份甘藍型油菜種質抗旱性分級

圖2 干旱處理下120份甘藍型油菜種質生理指標的變化Fig.2 Changes of physiological indexes of 120 Brassica napus L. varieties (lines) under drought treatment

2.4 抗旱生理指標主成分分析

為了更充分揭示不同甘藍型油菜種質各抗旱生理指標的變異特征值，對上述8個生理指標進行了主成分分析(表4)。可以看出，主成分1、2、3對抗旱指數的貢獻率分別為32.996%、19.174%和11.58%，累計貢獻率為63.75%，說明這3個主成分覆蓋了大部分原始數據的信息。

主成分1中載荷最高的因子為可溶性蛋白含量，其次為可溶性糖，且特征向量均為正值，抗旱指數特征向量也為正值。說明該主成分為滲透調節控制因子，且可溶性蛋白和可溶性糖的增加有利于甘藍型油菜抗旱性提高。

表3 各生理指標間的相關系數Table 3 Correlation coefficients among physiological indexes

注：*為在0.05水平上顯著相關，**為在0.01水平上極顯著相關。Y為抗旱指數,X1為葉綠素相對數量,X2為葉片含水量,X3為地上部干重,X4為葉片保水力，X5為可溶性蛋白，X6為丙二醛，X7為可溶性糖，X8為脯氨酸。

Note: * indicates the significant level of 0.05; ** indicates the significant level of 0.01. Y-DRI,X1-spad,X2-leaf water content,X3-above ground dry weight,X4-blade water recention,X5-soluble protein,X6-MDA content,X7-soluble sugar,X8-proline.

主成分2中抗旱指數特征向量為正，載荷最高的因子是離體葉片保水力，其次是葉片含水量，且特征向量也為正值。說明此因子為水分保持因子，葉片的保水力越強、含水量越高甘藍型油菜的抗旱性越強。

主成分3中載荷最高的因子為丙二醛含量，且該因子特征向量為正值，但抗旱指數的特征向量值為負。說明此因子為反映細胞膜損傷因子，丙二醛含量越高，甘藍型油菜的抗旱性越差。

2.5 各生理指標對抗旱指數間的通徑分析

為分析120份甘藍型油菜種質的8個抗旱生理指標對抗旱指數的影響，首先確定抗旱指數與 8 個生理指標間是否存在線性回歸關系。線性回歸方差分析表明，F=80.71，達到極顯著水平，說明抗旱指數與8個生理指標間存在極顯著線性關系，可以進行通徑分析(表5)。120份甘藍型油菜種質 8 個生理指標對抗旱指數的直接貢獻大小依次為可溶性蛋白(0.384)>葉片保水力(0.377)>可溶性糖(0.366)>丙二醛(|-0.347|)>葉片含水量(0.047)>SPAD值(|-0.041|)>地上部干重(0.035)>脯氨酸(|0.001|)。對抗旱指數直接貢獻較大且為正效應的是可溶性蛋白、葉片保水力和可溶性糖。同時可溶性蛋白、葉片保水力和可溶性糖與抗旱指數呈極顯著正相關，說明提高這3個生理指標有利于抗旱性的提高。

在8個生理指標分別通過其他指標對抗旱指數的間接綜合效應中，除丙二醛為負效應(-0.049)外，其余7個生理指標通過其他指標間接作用綜合效應為正，且由大到小依次為SPAD值(0.196)>脯氨酸(0.132)>可溶性蛋白(0.079)>葉片含水量(0.074)>地上部干重(0.068)>葉片保水力(0.057)>可溶性糖(0.055)。

表4 抗旱指標主成分分析

3 討 論

作物抗旱性的研究方法主要有人為控制土壤含水量和模擬干旱，其中以模擬干旱應用最多，用PEG-6000高滲透溶液模擬干旱的方法操作簡單，而且PEG溶液不會被植物體吸收，對植物無毒害、試驗重復性好、周期短等特點，適用于大批量材料的抗旱性快速鑒定[16]。

油菜的抗旱性是一個復雜的數量性狀，抗旱性鑒定的關鍵是選擇合適的形態和生理指標。前人對小麥的抗旱性研究表明，小麥生理指標與抗旱性的相關性大于農藝性狀指標[17]；本研究通過對120份甘藍型油菜品種(系)干旱處理下(以正常為對照)生理指標進行測定，結果表明各生理指標與抗旱指數的相關性較顯著，與前人的研究結果相似。干旱脅迫下植物細胞內富集大量活性氧，引發膜脂過氧化自由基鏈式反應，破壞膜的正常功能，并且產生和積累過氧化產物MDA[18-19]。本研究表明，PEG-6000模擬干旱脅迫后油菜幼苗體內MDA含量呈現增加趨勢，且增加量與幼苗的抗旱性呈極顯著負相關。滲透調節能力與作物的抗旱性有著直接的關系，滲透調節能力強的材料葉片和根系的保水能力也相對較強，可保持相對正常的呼吸作用，使葉片有相對高的水勢，能在干旱脅迫條件下保持正常的光合作用，可以在生殖生長階段吸收更多的水分，并且干旱條件下維持根系的生長[20-21]。Abbasian等[22]研究表明滲透調節可以用作甘藍型油菜抗旱品種選育時抗旱性鑒定指標。本研究通過測定模擬干旱處理材料可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸等滲透調節物質，發現這些作物體內的滲透調節物質在受到干旱脅迫后在絕大多數材料中均呈升高趨勢，且升高程度與各油菜品種(系)的抗旱指數呈極顯著的相關關系，這與前人的研究結果具有相同之處。

表5 8個生理指標對抗旱指數的通徑系數

本研究在PEG-6000模擬干旱條件下，鑒定甘藍型油菜的抗旱性，篩選出抗旱和敏旱的種質材料;并采用相關分析、主成分分析和通徑分析等方法，探討甘藍型油菜的抗旱性與油菜8個抗旱相關的指標之間的關系，結果表明，與甘藍型油菜抗旱相關的指標主要有可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛和離體葉片保水力等，這些性狀可作為甘藍型油菜抗旱性苗期鑒定的指標。