Wnt3a在小鼠黑色素細胞中的表達研究

趙園園，孟金柱

（銅仁學院 農林工程與規劃學院，貴州 銅仁 554300）

1 引言

黑色素在黑色素細胞的黑素小體中合成，并轉運到鄰近的角化細胞，使皮膚和毛發呈現出顏色。黑色素細胞是由神經嵴細胞分化而來的，中間經歷黑色素母細胞和黑色素干細胞，其中黑色素母細胞需遷移至表皮及毛囊，黑色素干細胞需要遷移到毛母質區分化成黑色素細胞，或定居于毛囊外根鞘 Bulge 區作為儲存庫[1]。

神經嵴細胞向黑色素細胞的分化主要受 Wnt信號通路和BMP信號通路的調控[2]。其中，Wnt家族的蛋白是分泌型糖蛋白，通過細胞表面受體介導調控發揮作用[3]。Wnt3a 作為 Wnt 家族的成員之一，通過與黑色素細胞表面的受體FZD結合，在促進神經嵴細胞向黑色素細胞的分化、黑色素的合成過程中起重要作用[4]。

先前的研究表明，Wnt3a 在黑色素細胞外，通過與細胞表面的受體結合發揮作用，但對其在黑色素細胞內的作用研究較少。本研究培養小鼠黑色素細胞，通過免疫熒光技術對黑色素細胞中Wnt3a 蛋白進行定位研究，為進一步探究 Wnt3a在色素沉積中的作用提供基礎。

2 材料與方法

2.1 材料

本研究所用小鼠黑色素細胞由山西農業大學羊駝生物工程實驗室提供。

2.2 方法

2.2.1 細胞培養 細胞的復蘇、培養、傳代、凍存方法參照MiR-27a-3p對黑色素生成的作用及機制研究[5]。

2.2.2 免疫熒光 當培養的黑色素細胞密度達到80%左右時，進行傳代，傳代細胞均勻平鋪于鋪有經1%鹽酸處理的蓋玻片的6孔細胞培養板中，待細胞長滿，棄培養基，滅菌的PBS清洗細胞3次，以去除死細胞。4%多聚甲醛低溫固定30 min，取出蓋玻片，PBS洗3次，每次3 min，0.5%TritonX-100室溫20 min，BS洗3次，每次3 min，室溫下用山羊血清封閉30 min，滴加 Wnt3a抗體（ab219412，abcam，1：200 稀釋）濕盒中4℃ 過夜孵育，復溫30 min，PBST洗3次，SABCFITC（山羊IgG）（1：100，博士德）37℃ 孵育1 h，PBST 洗 3次，吸干水，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下用藍光激發熒光，觀察，采集圖像。

3 結果

3.1 小鼠皮膚黑色素細胞生長狀況

待小鼠皮膚黑色素細胞生長至密度為 80%左右時，顯微鏡下觀察其形態結構，發現細胞排列緊密，呈鵝卵石狀，細胞有1～3個突起。細胞排列密集時，突起減少，分布稀疏時，細胞突起明顯且較多（見圖 1）。

圖1 小鼠黑色素細胞

3.2 Wnt3a 在小鼠皮膚黑色素細胞中的表達

圖2 Wnt3a在綿羊皮膚黑色素細胞中的表達定位

通過免疫熒光檢測發現，Wnt3a 在小鼠皮膚黑色素細胞中有表達，且表達部位主要集中在細胞核附近，其他部位表達量較少（見圖 2）。

4 討論

本研究通過免疫熒光技術對成熟的皮膚黑色素細胞中 Wnt3a 的表達進行研究，結果表明，Wnt3a 蛋白在成熟黑色素細胞中表達，這與筆者先前通過QRT-PCR 和 Western Blot檢測結果一致，Wnt3a在小鼠皮膚黑色素細胞中表達[5]。郭海英通過免疫組化檢測小鼠毛囊 Wnt3a的表達，發現在小鼠毛囊的生長期，毛球部的黑色素細胞表達 Wnt3a[1]。宋云飛檢測不同毛色羊駝皮膚中 Wnt3a 的表達，也發現其在毛球部和根鞘表達，這些結果也與本研究結果相契合[6]。

Wnt3a可以促進神經嵴細胞分化為黑色素細胞，且在黑素色生成過程中發揮積極作用，但 Wnt3a 抑制成熟黑色素細胞的增殖[7]。Wnt/β-catenin 信號通路需要與受體結合發揮作用，Wnt3a已知的受體包括Fzd1、Fzd3、Fzd8和LRP6[4,8,9]。在黑色素合成過程中，Wnt3a主要通過上調 Mitf、Tyr、Tyrp1 的表達，從而增加酪氨酸酶活性和黑色素合成[7]。