優化后精液孵育時間對精子DNA完整性、頂體反應率及IUI臨床結局的影響

彭潔，易兵，戚青林

（江西省萍鄉市婦幼保健院，萍鄉337000）

精液優化是輔助生殖技術中男性精子優選的重要手段，但優化過程的操作時間及力度、離心力、離心時間等因素均可造成精子DNA損傷[1]。采用密度梯度法優化精液大概耗時40-60min，優化后精液經孵育后行IUI手術，但是孵育時間的長短及與臨床結局的關聯還不明確，缺乏相關指南及標準。優化后的的精子具有運動活躍、濃度高的特點，孵育后可促進精子的獲能[2]，有利于受精，但精子碰撞及ROS水平均增多，反而可能促進DNA損傷及自發頂體反應的發生，因此確定獲得最佳臨床結局的孵育時間閾值具有重要意義。本研究旨在探討IUI精液優化后孵育時間的最佳范圍。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對2016年1月-2019年1月萍鄉市婦幼保健院生殖醫學科完成的IUI周期進行回顧性分析。納入標準：⑴女方年齡＜35歲；⑵進入IUI周期前篩查精子DNA碎片率（DFI）＜30%，精子自發頂體反應率（AR）＜10%；⑶采用非連續密度梯度法優化精液，優化后PR總數≥5×106。排除標準：采用上游法處理；優化后PR總數＜5×106；女方年齡＞35歲。最終納入168個IUI周期，其中促排卵周期122個，自然周期46個；男方年齡(33.02±4.70)歲，女方年齡(30.94±2.03)歲。收集優化后精液孵育時間、臨床妊娠、自然流產及活產等資料，并分析優化后精液孵育時間與精子DFI、自發AR率及IUI臨床結局的相關性。

1.2 方法

1.2.1 精液優化方案 采用非連續密度梯度離心法：包括梯度液配置、加樣、分離、洗滌等步驟。梯度液（SAGE）配置：上層1.5ml 40%梯度液+下層1.5ml 80%梯度液，加樣：在40%梯度液上方加入1.5ml完全液化的精液，分離：400g離心20min，洗滌：沉淀轉移至4ml精子洗液，200g離心5min，沉淀加入適量G-IVF，最終體積0.6ml，37℃孵育備用，并記錄孵育時間（即從精液優化完成后至送入宮腔前的時間間隔）。

1.2.2 精子DNA碎片檢測 分別收集精液優化完成、孵育完成時的兩份標本各20μl用于精子DNA碎片的檢測。試劑盒采用安科生物《精子DNA碎片檢測試劑盒》。精子DNA碎片檢測采用SCD法，包括制片、變性、裂解、洗滌、脫水、染色等步驟。400光學顯微鏡計數。精子DNA碎片指數（DFI）=（小暈環精子數+無暈環精子數）/計數精子總數×100%。

1.2.3 精子自發頂體反應檢測 分別收集精液優化完成、孵育完成時的兩份標本各20μl用于精子自發頂體反應的檢測。試劑盒采用安科生物《精子自發頂體反應檢測試劑盒》。精子自發頂體反應檢測采用PSA-FITC染色，包括制片、固定、染色、熒光顯微鏡觀察等步驟。用450-490nm激發光，于400倍鏡下觀察并計數精子200條以上。頂體完整（AI）：精子頭部一半以上熒光染色明亮且均勻；已發生頂體反應（AR）：精子僅在赤道帶出現熒光帶或者頂體區沒有熒光染色；頂體異常：除上述兩類精子外的所有精子，該類精子不計數。自發頂體反應率=AR精子數/計數精子總數×100%。

1.3 統計分析 采用SPSS17.0統計分析數據，計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用()表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較則采用單因素ANOVA分析。均以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 優化后精液孵育時間對精子DFI的影響 與孵育前比較，孵育46-60min、61-90min、91-120min后的精子DFI均顯著升高 （P＜0.05）。單因素ANOVA分析結果顯示，孵育前各組精子DFI比較均無統計學差異（P＞0.05）；孵育后各組精子DFI比較有統計學差異（F=5.516，P=0.000），孵育61-90min、91-120min組的精子DFI均顯著高于0-15min、16-30min、31-45min、46-60min組(P＜0.05)，見表1。

2.2 優化后精液孵育時間對精子自發頂體反應率的影響 與孵育前比較，孵育46-60min、61-90min、91-120min后的精子自發AR率均顯著升高（P＜0.05）。單因素ANOVA分析結果顯示，孵育前各組精子自發AR率比較均無統計學差異（P＞0.05）；孵育后各組精子自發AR率比較有統計學差異（F=7.424，P=0.000），61-90min、91-120min的精子自發AR率均顯著高于0-15min、16-30min、31-45min、46-60min（P＜0.05），見表2。

2.3 優化后精液孵育時間對IUI臨床結局的影響當孵育時間0-45min時，臨床妊娠率逐漸升高，31-45min妊娠率最高；孵育時間46-120min時，臨床妊娠率逐漸下降，但各組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。各組自然流產率、活產率比較也均未見統計學差異（P＞0.05），見表3。

表1 優化后精液孵育時間對精子DFI的影響

表2 優化后精液孵育時間對精子自發頂體反應率的影響

表3 優化后精液孵育時間對IUI臨床結局的影響(%)

3 討論

精子獲能是指成熟精子經過一系列生理生化變化獲得受精能力的過程，人工授精的精子主要通過體外途徑獲能，因為系列精子洗液、受精液中均含有葡萄糖、乳酸鹽、丙酮酸鹽和白蛋白等能量物質，在體外37℃孵育適當時間可完成精子獲能[3]。體外孵育雖然有利于精子獲能，但也可能會造成精子損傷，因為優化后的精子濃度及活力均較高、多呈直線運動、且運動速度快，極大地增加了精子的碰撞機率、能量損耗及ROS水平，損傷精子DNA、RNA、蛋白質和脂質成分，從而影響精子的受精能力[4]。本研究結果顯示，孵育后精子DFI、自發AR率隨時間增長呈逐漸升高趨勢，孵育0-45min對精子DFI及自發AR率并無明顯影響；而孵育46-120min時，精子DFI及自發AR率顯著高于孵育前，與梁嘉穎[5]等報道的正常、少、弱、畸形精子癥患者優化后精液孵育40min后精子質量顯著降低的結果類似。Enkhmaa[6]等研究顯示隨孵育時間增長（1h、4h與18h）ROS水平逐漸升高，提示高濃度精子產生大量的ROS，可能是導致DNA損傷及精子質量下降的重要原因。在體外獲能培養液中，自發AR率隨孵育時間延長呈依賴性增長，而發生自發頂體反應的精子則喪失了受精能力，導致受精率降低。段彪[7]等研究顯示優化后精液獲能1h時的IVF受精率顯著高于2h及4h，華月琴[8]等研究顯示優化后精液獲能0.5h時可獲得最好的IVF受精率，提示孵育獲能0.5-1h有利于精卵受精，可能與精子自發頂體反應率較低有關，與本研究結果類似。

此外還發現孵育時間31-45min時IUI臨床妊娠率最高，但各組妊娠率、自然流產率及活產率比較均無統計學差異，與梁嘉穎[9]等報道的優化后精液孵育20-39 min IUI臨床妊娠率最高類似。FAUQUE[10]等研究也顯示優化后精液孵育40-80min可獲得最高的臨床妊娠率?？赡茉驗榉跤龝r間過短可導致精子染色體解凝度降低[11]，過長則促進精子DNA損傷及自發頂體反應率的發生，降低精子受精能力，孵育31-45min可能是獲得IUI妊娠的適宜時間。此外，本研究發現孵育時間46-120min時，自然流產率呈逐漸升高趨勢，但差異無統計學意義。精子DNA碎片率高是導致自然流產的主要男方因素，孵育時間過長導致精子DNA損傷加劇，可能是IUI流產率升高的原因，樣本量少可能是導致臨床結局數據無統計學差異的原因。

綜上所述，精液優化后孵育時間越長，對精子DNA完整性及精子受精能力均會產生不利影響，但臨床結局變化并不明顯，這可能與樣本量較少有關。關于IUI精液優化后孵育時間對精子功能及臨床結局的影響，仍需多中心大樣本的研究，從而發現獲得最佳臨床結局的孵育時間閾值，有利于各生殖中心IUI實驗室精液獲能條件的標準化。