組織芯片對多發性骨髓瘤臨床診斷價值的研究＊

盛以蕓，徐姍，淦柳根，吳萍，江曉珍

（江西省南昌大學第一附屬醫院病理科，南昌330006）

多發性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是來源于分化晚期B細胞的血液系統惡性腫瘤，其發病率約占血液系統腫瘤的10%，在血液系統惡性腫瘤中占第二位[1]。MM多發于中、老年人，患者的生存時間從數月到十余年不等，自然病程差異大，具有明顯的異質性。其特征是骨髓中單克隆漿細胞的無限增殖和異常聚集，常浸潤骨骼和軟組織，引起多發性溶骨性損害，產生高鈣血癥、貧血、腎功能損害和免疫功能異常等癥狀，其血清或尿中亦會出現單克隆免疫球蛋白（M蛋白）[2,3]。研究發現，MM患者幾乎都存在細胞遺傳學的異常，包括染色體遺傳物質擴增、染色體缺失、染色體異位等，其發病、分期及預后都與之密切相關，因此，細胞遺傳學異常是決定腫瘤異質性的重要因素，是決定MM患者生存期的關鍵影響因素[4]。

常規方法對MM染色體異常的檢出率低，以FISH為代表的分子遺傳學技術克服了常規細胞遺傳學特異性和敏感性不高的缺陷，提高了染色體異常的檢出率，但其檢測的對象主要為骨髓細胞提取單個核細胞或細胞培養后行相關遺傳學檢測，而通過石蠟切片檢測MM的相關研究鮮有報道。本研究收集我院近4年來確診的30例初治MM患者的臨床及病理資料，采用組織芯片技術將石蠟包埋MM組織重新制片，并分別用免疫組織化學法及FISH法檢測MM免疫表型及分子遺傳學的異常情況，旨在為臨床判斷MM患者危險分層及預后提供更多分子遺傳學信息。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2014年1月-2018年12月期間在我院確診的初治MM患者的臨床資料、病理資料及骨髓瘤標本。納入標準：⑴診斷標準符合2017年修訂的中國MM診治指南[2]；⑵初治患者；⑶預計生存期在6個月以上；⑷活檢標本量較大，足夠用組織芯片技術重新制片。排除標準：⑴資料不完整者；⑵骨髓瘤標本較少，不足以用組織芯片技術重新制片者。本組共納入30例,男18例，女12例,確診時年齡55-79歲,中位年齡（66.9±5.7）歲。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片制作方法⑴將MM標本經10%中性福爾馬林充分固定、脫水、石蠟包埋，常規切片HE染色；⑵復核HE切片，并在玻片上標記相關區域；⑶組織芯片制作儀在無組織的空白蠟塊上鉆孔(直徑2 mm)；⑷借助玻片上的標記找準蠟塊上的相應部位，鉆孔采集組織芯；⑸將組織芯轉移到空白蠟塊的孔中；⑹重復以上步驟，將數十個組織芯整齊有序地安插在空白蠟塊中；⑺對組織芯片蠟塊進行切片并重新對切片進行HE染色。

1.2.2 免疫組織化學染色及檢測 將切好的白片用EliVisionTM法進行免疫組化染色，所用抗體及緩沖液均購自福建邁新公司（中國），試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司（中國）。

1.2.3 FISH法檢測 將組織芯片石蠟切片進行預處理（清洗載玻片、切片常規脫蠟、蛋白酶K消化、脫水、干燥、預熱等），采用的探針為1q21、17p13及t(4;14)(p16.3;q32)，所用試劑盒均購于北京金菩嘉醫療科技有限公司（中國）。

1.2.4 結果判讀 由2位以上副主任醫師采用雙盲法判斷檢測結果，陽性閾值采用的是2018版歐洲骨髓瘤網絡（european myeloma network,EMN）的標準，即缺失或擴增探針的陽性閾值為20%，異位或斷裂探針的陽性閾值為10%[5]。

2 結果

2.1 免疫組化染色結果 采用免疫組織化學法檢測檢測MM組織芯片中CKS1B表達的陽性率為66%（20/30），FGFR3表達陽性率為73%（22/30），p53蛋白陰性表達的檢出率為10%（3/30）。

2.2 FISH結果 使用FISH檢出MM組織芯片中至少1個以上染色體出現異常的發生率為83%（25/30）,其中1q21的檢出率為60%（18/30），17p13的檢出率為26%（8/30），t(4;14)(p16.3;q32)的檢出率為46%（14/30），2個或3個染色體同時出現異常的的檢出率為36%（11/30）。免疫組化染色及FISH結果見表1。

3 討論

大部分MM 患者都存在不同程度的細胞和分子遺傳學異常，較為常見的細胞遺傳學異常包括染色體1q21擴增、t(4;14)、17p13缺失、t(11;14)以及13q14等[6]。王存邦等[7]利用FISH法對86例MM患者進行檢測，發現有68例檢測出1種以上的分子遺傳學異常，總檢出率為79.07%，較本研究中的總檢出率（83%）稍低。

1q21擴增是MM常見的分子遺傳學異常。阿肯色州立醫學院骨髓瘤研究治療中心經過十幾年的研究發現，MM患者染色體1q21區域擴增與疾病的預后顯著相關，43%的初次確診患者，45%的治療中患者,以及72%的復發患者在其染色體中都存在1q21擴增現象[8,9]，且復發病人的1q21擴增拷貝數及腫瘤細胞數均明顯多于初診患者。這些證據說明1q21擴增與MM預后密切相關，可能正是由于此原因才導致了MM病人的復發和高死亡率。基因CKS1B位于lq21擴增區域的片段上，與MM的關聯性比其它基因更強,其表達與1q21擴增密切相關，且CKS1B在MM初發患者中高表達，在復發患者中的表達則更高[8]。有研究表明，在MM細胞中敲除CKS1B基因,結果導致嚴重的細胞凋亡和生長受抑制[10]。另外有學者發現，對CKS1B基因高表達的患者進行骨髓移植治療會使生存期變短[11]。因此，1q21擴增與CKS1B基因高表達可以作為MM的診斷標志和判斷預后的指標。目前，國內外文獻報道的1q21擴增的檢出率不盡相同，從20%~42.5%不等[12,13]。本研究利用組織芯片技術結合FISH法的檢出率為60%，明顯高于常規檢測方法。

表1 30例MM患者免疫組化染色及FISH結果

17p13缺失是國內MM患者較常見的一種染色體異常[14]。腫瘤抑制基因p53定位于17p13，17 p13的缺失導致p53丟失。P53在人體內發揮多種重要功能，包括抑制細胞增殖、與病毒蛋白或細胞蛋白結合而抑癌、監視損傷和誘導細胞凋亡、誘導細胞分化、影響其它基因的表達等[15,16]。p53基因結構及表達異常是迄今為止人類腫瘤中最為常見的遺傳學異常現象之一,約50%的人類實體腫瘤中存在p53基因的突變,該基因與患者的預后有一定的相關性,可作為一種判斷預后的獨立可靠的生物學指標[17-19]。然而，與實體腫瘤不同的是，血液系統腫瘤中p53基因突變的發生率較低,在初診的MM患者中的發生率約為5%，進展期或復發時約為20%~40%[20]。多數研究認為，p53基因缺失導致MM患者預后不良。Chang等[21]的一項針對105例MM患者的研究中顯示，10（9.5%）例出現p53基因缺失，經過4年隨訪統計,發現缺失組與未缺失組的無進展生存期分別為7.9和25.7個月,總生存期分別為14.7和48.1個月，p53基因缺失組生存期明顯縮短。本研究中初治MM患者17p13缺失的檢出率為26%，高于國內文獻報道[22]。

IGH基因位于14號染色體，它可與其它多個染色體發生易位形成融合基因[23]。IGH基因易位可以是原發的遺傳學事件,也可以發生在疾病的進展期。MM中IgH基因易位累及的染色體多達20種以上，不同的IGH基因易位具有不同的臨床意義，目前較為明確的主要有t(4;14)(p16.3;q32)、t(11;14)(q13;q32)以及t(14;16)(q32;q23)3種，其中最常出現的是t(4;14)(p16.3;q32)[24]。MM患者發生t(4;14)(p16.3;q32)易位后，會使成纖維細胞生長因子受體3（fibroblast growth factor receptors 3，FGFR3）過度表達，從而激活突變，導致腫瘤的發生[25]。FGFR3基因定位在染色體4p16.3,近年來被認為是一個腫瘤相關基因，其基因的突變及過表達與某些腫瘤，如膀胱癌、宮頸癌、慢性白血病、惡性漿細胞瘤、MM等均有關[26,27]。有研究表明，伴t(4;14)的多發性骨髓瘤患者平均生存期為644天，不伴t(4;14)平均生存期為1288d,提示t(4;14)對預后有不良影響；但FGF R3的表達和生存期并無明顯相關性,提示t(4;14)對MM患者預后的影響并不依賴于FGFR3[28]。國內劉丹等[29]報道t(4;14)(p16.3;q32)的檢出率為48.5%，與本研究檢出率基本一致。

組織芯片技術在1986年首次被提出，自1998年開始被大規模應用于各個臨床及檢測機構[30]。組織芯片具有如下優點：⑴體積小，信息量大，一次性實驗即可獲得大量結果；⑵在實驗中組織芯片上的所有組織都處在相同條件,因此較傳統的一個病例一張切片的實驗誤差小；⑶由于各種組織排列在一起可互為對照，閱片時易于比較；⑷省時,省力，節約開支。組織芯片可用于組織中的DNA、RNA和蛋白質的定位分析和檢測，也可像普通組織切片一樣,可做HE染色、特殊染色、免疫組織化學及熒光原位雜交。制成的組織芯片蠟塊可做100~200張連續切片，用同一套組織芯片即可迅速地對上百種生物分子標記進行分析檢測。從本研究中可以看出，組織芯片技術與免疫組化染色及FISH結合后，對MM的染色體及分子異常的檢出率高于常規檢測方法。盡管組織芯片技術應用于MM的檢測具有眾多優點,但也有其不足之處，如需要的標本量較大，常規穿刺活檢標本量可能不足以重新制片,組織芯片制片時的技術難度也高于常規切片，另外，由于組織較局限，很難解決腫瘤異質性問題。盡管如此，組織芯片技術在MM分子及遺傳學異常的檢測中仍然有非常可觀的應用前景。

綜上所述,組織芯片應用于MM分子及遺傳學異常的檢測中，具有信息量大、較常規檢測方法檢出率高、節約開支等優點，可為臨床判斷患者危險分層及預后提供更多分子遺傳學信息。