不同分子分型乳腺癌中的K-ras基因突變檢測及其意義＊

張振東，胡瀧，王珊珊，萬紅萍，陳任生，梅金紅，陶雪勤

（南昌大學第一附屬醫院病理科，南昌330006）

根據最新國家癌癥中心全國癌癥統計數據，乳腺癌仍為我國女性惡性腫瘤發病首位，每年新發病約為30.4萬且發病率逐年增高[1]。乳腺癌具有高度異質性的特點，利用乳腺癌基因表型不同進行分子分型，對乳腺癌的個體化治療和預后有重要指導價值，是臨床進行內分泌治療和靶向治療的重要支持。隨著研究的深入，乳腺癌分子分型的概念不斷得到補充，分型更加細化，為臨床探索新的藥物治療提供了新的理論支持。西妥昔單抗作為EGFR抑制劑，已應用于多種實體瘤的治療，如結直腸癌。有研究表明，乳腺癌也可高表達EGFR[2]，西妥昔單抗是否能用于乳腺癌治療，與乳腺癌分子分型是否相關，目前尚缺乏相關研究及報道。本文擬初步檢測50例乳腺癌患者不同分子分型之間K-ras基因的突變情況，為臨床應用乳腺癌分子分型進行靶向治療提供更多理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年1月-2015年12月在南昌大學第一附屬醫院行乳腺癌根治術標本50例。所有病例經病理確診均為原發乳腺癌（浸潤性癌），其中浸潤性癌，非特殊類型44例，浸潤性小葉癌6例。患者年齡34-65歲，平均年齡45.2歲。術前均未行化療治療且無其他惡性腫瘤病史。

1.2 方法

1.2.1 采用Envision 二步法檢測ER、PR、HER2、Ki-67表達情況，免疫組化染色由羅氏Ventana全自動免疫組化染色儀完成。ER、PR、HER-2一抗購自羅氏，Ki-67購自福建邁新，均為即用型工作液。利用PBS(pH=7.4)代替一抗作為空白對照，已知陰性片和陽性片分別作為陰性和陽性對照。經2名病理醫師分別閱片，結果一致者作為確診結果。ER、PR陽性定位于細胞核，陽性細胞為細胞核內可見棕黃色顆粒沉淀，ER、PR陽性標準為陽性腫瘤細胞數>1%[3]。HER-2蛋白陽性定位于細胞膜，HER-2陽性標準為浸潤性腫瘤呈現強而完整的細胞膜染色且陽性細胞數量>10%[4]。Ki-67陽性定位于細胞核，對整張切片的Ki-67陽性指數進行平均評估（選取視野時應包括熱點區域在內的3個或3個以上浸潤性癌高倍視野，總數500個以上浸潤性癌細胞）。分子分型參照《St.Gallen共識》(2015年)[5]，將乳腺癌確定為4種分子分型:⑴Luminal A型:ER/PR陽性且PR高表達（≥20%），HER2陰性,Ki-67低表達（＜20%）；⑵Luminal B型:ER/PR陽性，若HER2陽性則Ki-67可任何狀態，若HER2陰性Ki-67高表達或PR低表達；⑶HER2過度表達型:ER、PR均陰性、HER2陽性；⑷Basal-like型(三陰性乳腺癌):ER、PR陰性、無HER2蛋白過表達或基因擴增。

1.2.2 石蠟標本 DNA提取試劑盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit購于德國Qiagen公司。人K-ras基因7種突變(Gly12Ala、Gly12Asp、Gly12Arg、Gly 12Cys、Gly12Ser、Gly12Val、Gly13Asp)檢測試劑盒由廈門艾德生物醫藥科技有限公司提供，基于實時熒光定量PCR平臺結合特異引物和雙環探針兩種技術檢測人K-ras基因的第12和13密碼子上7種熱點體細胞突變；實時熒光定量PCR儀為美國LightCycler480。

基因組DNA提取:切取10μm厚組織8片，切片貼于干凈的玻片上。二甲苯脫蠟至水后，按照HE染色片所選取的腫瘤區域，小心用無菌刀片將腫瘤組織刮入1.5 ml的EP管中。應用石蠟組織DNA抽提試劑盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取DNA。DNA利用Nanodrop2000超微量分光光度計檢測其濃度及吸光度(A)值，0.8%瓊脂糖電泳判定其質量。

ARMS實時熒光定量PCR:每次試驗均設定各種突變的陰、陽性對照孔及內外控對照孔。反應循環參數：第一階段：95℃5 min，1個循環；第二階段：95℃25 S,64℃20 s,72℃20 S，15個循環；第三階段：93℃25 S，60℃35 S，72℃20 S，31個循環。信號收集：第三階段60℃時收集FAM和HEX(或VIC)信號。

結果判定：首先確定該樣品的外控FAM信號的Ct值，然后確定檢測樣品突變FAM信號Ct值。ΔCt值=突變Ct值（FAM）-外控Ct值（FAM）。由于樣品中突變百分含量各不相同，所得到的突變Ct值也各不相同。根據不同的突變Ct值或△Ct，把樣品檢測結果分為陰性、陽性。

表1 K-ras突變陽性、陰性判斷標準

2 結果

2.1 50例原發乳腺癌，按分子分型分為：Luminal A型12例，Luminal B型21例，HER2陽性型8例，三陰性乳腺癌9例。

2.2 Luminal A型、Luminal B型、HER2陽性型、三陰性乳腺癌均未檢測到K-ras基因突變，第12、13密碼子均為野生型。

表2 50例原發乳腺癌K-ras突變檢測結果

3 討論

圖1 Luminal A型乳腺癌K-ras擴增曲線；圖2 Luminal B型乳腺癌K-ras擴增曲線；圖3 HER2過度表達型乳腺癌K-ras擴增曲線；圖4三陰性型乳腺癌K-ras擴增曲線

乳腺癌分子分型的提出起初是基于基因芯片技術[6,13]。在實際臨床工作中，多數專家認為可根據免疫組化檢測的ER、PR、HER2、Ki-67結果，將乳腺癌劃分為4個類型，即Luminal A型、Luminal B型、HER2過表達型和三陰性型[5]。目前該分類已經普遍應用于臨床病理診斷及治療，對乳腺癌患者個體化治療具有重要的指導價值。對于Luminal A型患者，推薦直接行手術治療，術后再輔以內分泌治療；Luminal B型患者，由于瘤細胞增殖特點，可能通過新輔助化療得到良好的療效，因此可以先行術前輔助化療，再行手術切除[7]；HER2過表達型乳腺癌患者，聯合靶向藥物曲妥珠單抗療效明顯，且可明顯改善預后[14]；三陰型乳腺癌患者復發風險高，但有研究發現三陰型乳腺癌對于化療更敏感，化療是其重要治療手段[8]。

EGFR/K-ras通路在多種實體腫瘤包括非小細胞肺癌、胃癌、結直腸癌、卵巢癌等的發生發展中起著重要作用，EGFR已經成為非常重要的抗腫瘤靶點。有研究表明，乳腺癌組織內也高表達EGFR，提示西妥昔單抗具有治療乳腺癌的應用前景。近年來已有將西妥昔單抗用于治療乳腺癌的臨床前試驗，如史亞飛等[9]利用西妥昔單抗干預EGFR陽性的MCF-7細胞系，提示西妥昔單抗可減少腫瘤細胞數量并抑制其生長。Shou J等[10]研究發現，生長因子受體和ER-α可相互作用，上調增強TRK信號及ER-α的表達，建立雙向性刺激腫瘤細胞存活、增殖的惡性循環，提示乳腺癌治療可采用同時阻斷ER和EGFR信號通路的治療手段。K-ras基因在人乳腺癌組織中突變情況尚不是十分清楚。Miyakis等[11]的研究顯示乳腺癌組織中Hras和Kras基因發生突變概率為0和6.5%。本研究結果顯示50例不同分子類型乳腺癌標本中K-ras基因未檢測到突變，第12、13密碼子均為野生型，提示K-ras基因在乳腺癌組織中突變率極低，與文獻報道相符。提示大部分乳腺癌患者可從西妥昔單抗治療中獲益。

綜上所述，西妥昔單抗能抑制乳腺癌干細胞的生長，臨床前期試驗已經顯示出其與其他化療藥物及放療聯合應用的顯著效果[9，10,13]。K-ras基因野生型表達則是腫瘤患者使用EGFR抑制劑的前提，本實驗檢測乳腺癌病例中K-ras基因均為野生型，提示西妥昔單抗有可能成為乳腺癌的靶向抗腫瘤藥物，其在乳腺癌患者聯合治療中的價值及機制，仍需我們進一步研究，為乳腺癌個體化治療提供進一步理論支持。